★ 李秀瓊 袁慕榮 孫亞彬 劉思佳

(1.佛山市中醫(yī)院藥劑科 廣東 佛山 528000；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu) 廣東 廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部 廣東 廣州 510515)

羅丹明123(R123)又稱雙6-氨基3-亞胺基3H-氧雜蒽-9-yl苯甲酸甲酯，其分子式為C21H16N2O3·HCl，相對(duì)分子質(zhì)量為344.4。它是一種發(fā)黃綠色熒光的熒光染料，可以根據(jù)細(xì)胞膜的選擇性來染色活細(xì)胞線粒體,廣泛用作檢測(cè)線粒體膜電位，也常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。另外，R123可以快速通過細(xì)胞膜,高度選擇性地聚集在線粒體,并且對(duì)細(xì)胞沒有任何毒性，同時(shí)被多藥耐藥細(xì)胞(mμLtidrug resistance ,MDR)有效排出[1-5]。R123是P糖蛋白的一種底物，常用于癌癥研究[4,5]?，F(xiàn)在常用檢測(cè)R123的方法有：熒光分光光度計(jì)[6-8]，高效液相熒光檢測(cè)器[9,10]，酶標(biāo)儀[11]等。

R123作為多藥耐藥性體內(nèi)評(píng)價(jià)的指示劑時(shí),通常需要檢測(cè)其在血液中的濃度。但是現(xiàn)在還未發(fā)現(xiàn)有文章應(yīng)用LC-MS/MS系統(tǒng)的評(píng)價(jià)R123在血漿中的檢測(cè)方法學(xué)，并且考察其提取方法，精密度，靈敏度等。本文建立了用LC-MS/MS檢測(cè)血漿中R123濃度的方法學(xué)，并保證了分析方法快速，靈敏度高，高選擇性。

1 材料與方法

1.1 試劑 羅丹明123(批號(hào)：046K3688)；內(nèi)標(biāo)羅丹明6G(批號(hào)：1425911V)；甲醇，乙腈均為分析純，購自西格瑪公司(中國上海)。乙酸乙酯，二氯甲烷，碳酸氫鈉均為色譜純，購自CAF公司(中國廣州)。

1.2 裝置 Agilent 1100 Series液相色譜儀；Agilent 6410三重四極桿液相色譜/質(zhì)譜；Agilent MassHunter色譜管理系統(tǒng)。

1.3 LC-ESI-MS 用Zorbax Eclipse XDB C18column(150mm×3.5mm，5μm；Agilent, Wilmington, DE, USA)在柱溫為40℃時(shí)分離血漿中的待測(cè)物。流動(dòng)相為甲酸銨(包含5mM甲酸銨及1%的甲酸)和乙腈(5∶95)，流速為0.5mL/min。自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度設(shè)定為25℃

質(zhì)譜應(yīng)用陽離子多重反應(yīng)器(MRM)。離子噴霧電壓為+3.5kV，發(fā)熱氣體溫度為350℃，干燥氣體流速為10L/min。MRM用于數(shù)據(jù)采集。R123 MRM優(yōu)化后，離子碎片躍遷m/z 345～285，碰撞能量為44eV。R6G離子碎片躍遷m/z 443～415碰撞能量為41eV。每次躍遷時(shí)間為200ms。

1.4 制備標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控(QC)樣品。 精密稱取R123 1mg溶解于甲醇中，制成濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液用甲醇連續(xù)稀釋制成工作液濃度：1，2,10,50,100,150,200ng/mL。QC用儲(chǔ)備液用同樣的方法單獨(dú)稀釋，濃度分別為2,100,150ng/mL。內(nèi)標(biāo)用甲醇配成濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液，并稀釋成50ng/mL。所有溶液均保存于4℃環(huán)境中，使用前在室溫中放置。

1.5 血漿樣品的提取 將100μL內(nèi)標(biāo)(50ng/mL，用甲醇稀釋)蒸干后加入0.1mL血漿樣品中，然后加入0.1mL飽和碳酸氫鈉，混勻，再加3mL乙酸乙酯/二氯甲烷(4∶1)，混合后斡旋1min，之后3500轉(zhuǎn)離心10min。上清液轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃試管中，用真空干燥箱揮干。殘?jiān)?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，取2μL用于LC-MS/MS分析。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

1.6.1 選擇性 比較R123及內(nèi)標(biāo)分別在空白血漿及空白血漿中添加最低檢出限濃度的R123及濃度為50ng/mL的R6G及體內(nèi)含藥血漿中的MRM色譜圖，驗(yàn)證樣品的色譜峰沒有受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限(LLOQ) 血漿配置3組標(biāo)曲工作液，用于擬合標(biāo)曲。分析物及內(nèi)標(biāo)的比值使線性最小加權(quán)平方滿足條件后，3組工作液擬合出合適的標(biāo)曲，并且確定最低檢測(cè)限

1.6.3 回收率 檢測(cè)2,100,150ng/mL三個(gè)濃度的R123的血漿中提取回收率。血漿樣品中均加入等量一定濃度的內(nèi)標(biāo)。比較提取血漿后待測(cè)樣品的濃度與相對(duì)應(yīng)的原始濃度的比值即為提取回收率。

1.6.4 精密度與準(zhǔn)確度 將QC樣品配成三個(gè)濃度，并且每個(gè)濃度設(shè)置15個(gè)復(fù)孔，驗(yàn)證此方法學(xué)的日間及日內(nèi)的精密度及準(zhǔn)確度。精密度的結(jié)果用RSD。準(zhǔn)確度用RE%表示。

1.6.5 穩(wěn)定性 考察含有R123的血液樣本的室溫穩(wěn)定性，樣本的處理液穩(wěn)定性，以及反復(fù)凍融穩(wěn)定性。室溫穩(wěn)定性：室溫條件下放置1 h和24 h后，處理樣本，與新鮮配制的儲(chǔ)備液比較；樣本的處理液穩(wěn)定性：樣本處理后，1 h和24 h后進(jìn)樣分析，與新鮮配制的儲(chǔ)備液比較；反復(fù)凍融穩(wěn)定性：凍融1和3次后，處理進(jìn)樣分析，與新鮮配制的儲(chǔ)備液比較。當(dāng)貯備液濃度范圍與初始濃度相比在85%與115%之間時(shí)，被認(rèn)為是穩(wěn)定性良好的。凍融穩(wěn)定性溫度為-20℃～25℃反復(fù)循環(huán)。

1.6.6 介質(zhì)效應(yīng) 根據(jù)Matuszewski[12]的方法，進(jìn)行介質(zhì)效應(yīng)考察。由于實(shí)驗(yàn)中相關(guān)介質(zhì)物質(zhì)被洗脫出，可能造成介質(zhì)效應(yīng)或者潛在的離子效應(yīng)抑制或者增強(qiáng)。將空白血漿樣品按相同條件提取后，加入已知濃度，與QC樣品的濃度相比。內(nèi)標(biāo)的介質(zhì)效應(yīng)按相同方法在50ng/mL濃度時(shí)進(jìn)行考察。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件優(yōu)化 R123在Q1全掃描模式下，(M+H)離子具有較高的液質(zhì)響應(yīng)值，并且沒有觀察到其他的離子出現(xiàn)。子離子掃描時(shí)，當(dāng)CE值為44eV時(shí)，R123最大離子碎片為m/z=285。R6G作為R123的結(jié)構(gòu)類似物被用于做內(nèi)標(biāo)。R6G在全掃描模式下，母離子躍遷m/z=443。多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)下，子離子碎片在m/z=415時(shí)是穩(wěn)定的。R123及R6G的質(zhì)譜圖見圖1，2。

分別考察甲醇與乙腈的流動(dòng)相PH，緩沖液，組分對(duì)保留時(shí)間及分離度的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)背景的干擾力大于乙腈。選擇甲酸銨(包含5mM甲酸銨及1%的甲酸)和乙腈(20∶80)做為流動(dòng)相，R123與內(nèi)標(biāo)R6G的保留時(shí)間分別為2.807，3.15 min。

用乙酸乙酯，甲醇，二氯甲烷(單獨(dú)以及聯(lián)合用)做為提取溶劑時(shí)，提取回收率很低(小于45%或不相容)。當(dāng)選擇乙酸乙酯做為提取劑使，提取率明顯增高。實(shí)驗(yàn)最終選取乙酸乙酯∶二氯甲烷(4∶1)以及加入飽和碳酸氫鈉，與其他提取劑相比，提取效率最高，并且沒有發(fā)現(xiàn)雜峰。

圖1 R123全離子掃描圖譜

圖2 R6G子離子掃描圖譜

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 方法選擇性 從血漿中提取出的R123及R6G的3種典型MRM色譜圖如圖3所示。藥物及內(nèi)標(biāo)的色譜圖在各自的保留時(shí)間內(nèi)均沒有內(nèi)源性基質(zhì)的干擾。

A.空白血漿；B.空白血漿中添加最低檢出限濃度的R123及濃度為50ng/mL的R6G；C.尾靜脈注射R123 360min后測(cè)得的血漿中R123的MRM色譜圖

2.2.2 線性及LLOQ 標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1.1575X+0.0027，r=0.9999(n=7)，1ng/mL為最低檢測(cè)限。

2.2.3 回收率 R123在三個(gè)質(zhì)控濃度檢測(cè)下的提取回收率為87.73%，92.16%及91.23%。而內(nèi)標(biāo)的回收率為78.13%。R123及內(nèi)標(biāo)的回收率前后一致性良好并且沒有濃度依賴性。

2.2.4 精密度及準(zhǔn)確度 表一中總結(jié)了所有的相關(guān)值。日內(nèi)精密度分別為6.95%，3.33%，1.41%，日間精密度分別為：9.2%，3.02%，2.09%。準(zhǔn)確度范圍為-3.03%～5.26%。

表1 大鼠血漿R123準(zhǔn)確度及精密度

相對(duì)誤差(%)=[(平均濃度-理論濃度)/理論濃度]×100。2.2.5 穩(wěn)定性 表2總結(jié)了R123的樣品的穩(wěn)定性，并且沒發(fā)現(xiàn)顯著性的分解。數(shù)據(jù)表明R123是可以在實(shí)驗(yàn)條件下反復(fù)保存和提取的。

表2 大鼠血漿中R123的穩(wěn)定性測(cè)定(ng/mL,±s,n=15)

2.2.6 介質(zhì)效應(yīng) R123三個(gè)濃度的介質(zhì)效應(yīng)分別為：99.89%，99.26%和101.73%。內(nèi)標(biāo)的介質(zhì)效應(yīng)為101.88%。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用LC-MS/MS方法檢測(cè)人血漿中R123的濃度。方法的最低檢測(cè)限為1ng/mL，濃度范圍為1～200 ng/mL。LC-MS/MS是用于檢測(cè)血漿中R123含量的快速且靈敏的方法。

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