★ 王曉躍 鄧運明 王力 陳浩 王明森 李華南 褚小剛

(江西中醫(yī)藥大學 江西 南昌 330006)

人尿酸鹽陰離子蛋白1(hURAT1)是急性痛風性關節(jié)炎及高尿酸血癥發(fā)病機制中的重要候選基因，國內(nèi)多項研究顯示，hURAT1啟動子區(qū)SNP位點存在基因突變，與原發(fā)性高尿酸血癥及痛風相關[1-3]。近些年來，痛風性關節(jié)炎及高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高。鑒于高尿酸血癥是痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作期最主要的實驗室表現(xiàn)，大約10%～20%高尿酸血癥可發(fā)展為痛風，濕熱證型為痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作期最主要的證型等因素，本研究擬通過對急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型患者進行hURAT1啟動子區(qū)SNP測序，進一步明確hURAT1啟動子區(qū)SNP多態(tài)性與急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型的相關性，探究其可能的機制。

1 臨床資料

本研究中110例急性痛風性關節(jié)炎病例全部來自江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院門診及住院部病人，且相互無血緣關系。經(jīng)痛風性關節(jié)炎診斷標準及相關臨床檢查確診，符合納入標準的，患者均自愿接受本課題研究治療。

入選正常對照組115例常人均來至江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院體檢中心篩選的健康成人，經(jīng)全生化檢測、血壓測定及心電圖檢查等以排除冠心病、高血壓、糖尿病、高尿酸血癥、肝腎功能異常及家族病史者。

1.1 診斷標準 西醫(yī)診斷標準：采用1977年美國風濕病學會制訂的痛風診斷標準；中醫(yī)證候診斷標準：主要采用國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)病證診斷療效標準》中的“痛風的診斷依據(jù)、證候分類”標準中的“濕熱蘊結”證型。

1.2 納入標準 (1)符合上述西醫(yī)診斷標準；(2)年齡在18～65歲患者；(3)符合上述中醫(yī)辨證分型濕熱蘊結證；(4)知情并同意接受實驗方案。

1.3 排除標準 (1)不符合診斷標準和納入標準者；(2)合并有心、肺、肝、凝血功能障礙等嚴重疾病者；(3)急、慢性腎衰竭、腎病綜合征、腎小管疾病等引起的繼發(fā)性高尿酸血癥患者；(4)有風濕及類風濕類疾病者。

2 材料和實驗方法

2.1 實驗儀器 質(zhì)譜檢測儀(MassARRAY Analyzer Compact)；點樣儀(MassARRAY Samsung Nanodispenser)；384 孔雙頭 PCR 儀(GeneAmp?PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module)。

2.2 實驗試劑 Axygene96血基因組DNA小量制備試劑盒4×96；iPLEX反應試劑；384-well SpectroCHIP生物芯片；HOTSTART taq酶；SAP酶；純化瓊脂。

2.3 外周抗凝血DNA的提取 GA組及CON組研究對象于清晨空腹抽取外周靜脈血，其中一部分ACD抗凝并置于-70℃保存，一部分離心取血清，運用生化分析儀行測定尿酸、肌酐、尿素氮等指標。取ACD抗凝血0.2mL，用美國Axygene公司Axygene96血基因組DNA小量制備試劑盒提取血基因組DNA。

2.4 聚合酶鏈式反應(PCR) 依據(jù)引物設計原則，運用primer express5.0設計2對引物，擴增hURAT1基因啟動子區(qū)rs3825018。上游引物序列ACGTTGGATGATGCTGGAGGTCTCGGAATC，下游引物序列ACGTTGGATGTCTGCCTGCTGGTGTCACTT，擴增長度97bp，特異延伸引物TCTCGGAATCACCTCAC。

2.5 通過PCR擴增，dNTp降解 SAP酶處理，降解擴增用的dNTP，以確保延伸反應只延伸一個堿基。延伸引物單堿基延伸反應：配制iPlex反應體系，加入到SAP處理后的384孔板中，進行單堿基延伸反應。最后樹脂除鹽純化。

2.6 Nanodispenser SpectroCHIP芯片點樣將檢測樣品從384孔反應板轉移到表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAY SpectroCHIP芯片。MassARRAY Analyzer Compac質(zhì)譜檢測將樣品轉移到SpectroCHIP芯片后，全自動分析。TYPER4.0軟件分析實驗結果，獲得分型數(shù)據(jù)。

3 結果

3.1 急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型組與正常對照組臨床資料 見表1。

表1 急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型組與正常對照組臨床資料對比

注：Age：年齡；SUA：血尿酸；BUN：尿素氮；CRE：血肌酐。

痛風組110例與正常對照組115例在性別、年齡無顯著性差異(P>0.05)。急性痛風性關節(jié)炎組尿酸、尿素氮、血肌酐明顯高于對照組(P<0.05)，均具有統(tǒng)計學差異。

鑒于男性女性在尿酸水平上診斷標準不同，本研究對男性、女性進行分組比較，見表2。男性、女性急性痛風性關節(jié)炎組與對照組在年齡分布上無明顯差異(P=0.20)。痛風組男女比例為3.78∶1，痛風組男性、女性尿酸均明顯高于正常對照組(P<0.01)，具有統(tǒng)計學差異。痛風組男性尿酸水平明顯高于女性尿酸水平(P<0.05)，具有統(tǒng)計學差異。綜上，急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型組患者血尿酸水平較高，并發(fā)生腎功能異常風險較高；男性較女性更易患急性痛風性關節(jié)炎，且男性患者血尿酸水平明顯高于女性。

3.2 人尿酸鹽陰離子蛋白1(hURAT1)單核苷酸多態(tài)性(SNP)測序分析結果 本研究對110例急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型患者與正常對照組患者配對行hURAT1基因SNP序列分析，在中國江西漢族人群hURAT1啟動子區(qū)測序發(fā)現(xiàn)SNP位點，分別為rs3825018。

表2 男女性急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型組與正常對照組臨床資料對比

注：Age：年齡；SUA：血尿酸；BUN：尿素氮；CRE：血肌酐。

3.3 單核苷酸多態(tài)性(SNP)Hardy-Weinbery平衡檢驗及連鎖分析 本研究對象均由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院門診和住院部確診病人及體檢中心篩選出健康正常人，運用Hardy-Weinbery平衡檢驗研究人群是否符合隨即抽樣原則。在急性痛風性關節(jié)炎組及對照組中，4個SNPs基因型在225例研究對象中符合Hardy-Weinbery平衡分布(P>0.05)，符合選取研究對象隨機性的原則。

3.4 hURAT1啟動子區(qū)基因rs3825018基因頻率 對hURAT1啟動子區(qū)基因rs3825018 SNP基因型及等位基因頻率研究顯示，rs3825018雜合突變基因型(CT)、野生基因型(CC)、純和突變基因(TT)在對照組和痛風組中的分布，分別為43.5%對27.3%，53.9%對70.0%，2.6%對2.7%，與野生基因相比，雜合突變基因型在兩組中分布差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.012)。SNP位點rs3825018突變等位基因T基因頻率為16.4%，低于對照組的24.3%(P=0.048)，具有統(tǒng)計學差異，見表3。

表3 hURAT1啟動子區(qū)基因rs3825018頻率的比較

3.5 Logistic回歸分析 通過對hURAT1啟動子區(qū)中rs3825018 SNP位點進行Logistic回歸分析，進一步明確急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型的致病位點。Logistic回歸分析校正年齡和性別等因素后，結果顯示，急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型組rs3825018突變型等位基因頻率低于對照組(P=0.048)，雜合突變基因型者患急性痛風性關節(jié)炎的風險較野生基因者降低(OR=0.483),提示hURAT1啟動子區(qū)rs3825018 SNP位點中的突變性等位基因T為急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型的保護性等位基因。

3.6 結果 人尿酸鹽陰離子蛋白1(hURAT1)基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性SNP位點rs3825018與急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型密切相關，其突變性等位基因T為急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型的保護性等位基因。

4 討論

痛風性關節(jié)炎在古籍中稱“歷節(jié)”、“白虎歷節(jié)”、“白虎風”等名，屬中醫(yī)“痹證”范疇。中醫(yī)認為痛風性關節(jié)炎是脾虛失運，濕濁內(nèi)阻。脾虛為本，濕濁為標。若嗜食膏粱厚味、醇酒肥甘，或過度勞累、情志所傷，則進一步內(nèi)耗正氣，損傷脾胃，使脾虛日益加劇、脾運日趨減弱。久之濕濁為患，留滯體內(nèi)，流注骨節(jié)，氣血閉阻而作痛[4]。臨床分期各中醫(yī)證候構成上，濕熱蘊結證主要集中在急性期，痰濁阻滯證間歇期居多，瘀熱阻滯證、肝腎陰虛證則在慢性期居多。

急性痛風性關節(jié)炎其主要由于尿酸鈉在關節(jié)腔內(nèi)形成微晶體沉淀，引發(fā)非特異性關節(jié)炎癥。急性痛風性關節(jié)炎初期，因關節(jié)局部溫度較低、血尿酸水平升高、體液pH值減低及沉積晶體的脫落，大量尿酸鈉進入關節(jié)腔。尿酸鈉與免疫球蛋白結合后被吞噬細胞吞噬，吞噬細胞在尿酸鈉的作用下，激活環(huán)氧酶和脂氧酶，使花生四烯酸轉化成前列腺素，以及各種致炎物質(zhì)的作用，使得炎癥進一步發(fā)展[5]。

高尿酸血癥是痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作期最主要的實驗室表現(xiàn)，其主要是由于尿酸的排泄障礙所致。人機體內(nèi)尿酸存在腸道和腎臟兩個排泄途徑，其中腎臟排泄最為重要。尿酸在腎臟的排泄過程為：腎小球濾過，近端腎小管的重吸收，分泌與分泌后重吸收。正常情況下，血尿酸由腎小球濾過后90%經(jīng)近曲小管重吸收，再經(jīng)近曲小管遠端分泌而排出體外。近年來隨著對腎尿酸轉運蛋白的深入研究，人們在分子水平上對尿酸的排泄異常有了更進一步的認識。腎臟中尿酸排泄異常的基因主要包括人尿酸鹽轉運蛋白1(hURAT1)、人尿酸鹽轉運蛋白(hUAT)、有機陰離子轉運蛋白1(OAT1)[6]、尿調(diào)節(jié)素基因(UMOD gene)。其中，huRAT1參與腎近端小管重吸收尿酸，是維持機體血尿酸轉運的關鍵離子通道[7]。

人尿酸鹽陰離子交換器1(hURAT1)是參與尿酸鹽在腎近端小管重吸收重要的陰離子通道，對維持機體尿酸鹽動態(tài)平衡起關鍵性作用。hURAT1基因突變或活性的改變均可能對腎臟尿酸排泄產(chǎn)生影響?；谶@種假設，本研究通過病例研究，對hURAT1基因啟動子區(qū)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測，研究其與急性痛風性關節(jié)炎濕熱證型的相關性。

本研究對225例中國江西漢族人群hURAT1啟動子區(qū)測序發(fā)現(xiàn)rs3825018 SNP位點，該SNP基因型在225例研究對象中符合Hardy-Weinbery平衡分布(P>0.05)，符合選取研究對象隨機性的原則。對其基因型及等位基因頻率研究顯示，rs3825018雜合突變基因型(CT)、野生基因型(CC)、純和突變基因(TT)在對照組和痛風組中的分布，分別為43.5%對27.3%，53.9%對70.0%，2.6%對2.7%，與野生基因相比，雜合突變基因型在兩組中分布差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.012)。SNP位點rs3825018突變等位基因T基因頻率為16.4%，低于對照組的24.3%(P=0.048)，具有統(tǒng)計學差異。

近年來，已有歐洲、日本及國內(nèi)人群對hURAT1基因多態(tài)性與痛風相關性研究的報道。Kozl M等[8]運用meta分析對歐洲人群大規(guī)模血尿酸全基因組進行關聯(lián)性研究，提示hURAT1與血尿酸水平密切相關(P=2.04×10-9)。Li[9]等通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)對5'側翼區(qū)進行功能檢測，發(fā)現(xiàn)-253～+83為最小啟動子功能區(qū)域，該區(qū)域存在多個基因轉錄結合位點，提示該區(qū)域序列內(nèi)單個堿基突變，均可能影響基因轉錄的活性。本研究對225例中國江西漢族人群hURAT1基因SNP測序共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，均在最小啟動子區(qū)周圍，其可能是影響hURAT1基因轉錄活動的多態(tài)性位點，最終影響機體血尿酸平衡，其最主要的作用機制有待于進一步研究。

[1]韓琳.人尿酸鹽轉運子(hURAT1)與原發(fā)性高尿酸血癥遺傳易感性研究[D].青島大學,2008.

[2]孟曉梅.hURAT1基因啟動子區(qū)+292C/G突變與高尿酸血癥的相關性研究[D].青島大學,2009.

[3]于清.hURAT1基因啟動子區(qū)-87C/T SNP與原發(fā)性痛風的關聯(lián)及功能研究[D].青島大學,2011.

[4]汪文，蔡征．痛風性關節(jié)炎證治之管見：附68例舌苔分析圖[J].江蘇中醫(yī)，2001，22(6)：14-15.

[5]胥少汀,葛寶豐,許印坎.實用骨科學[M].第3版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：1 356-1 357.

[6]Ichida K ，Hosoyamada M，Kimura H，et al.Urate transport via human PAH Transporter h0AT1 and its gene strueture[J]. KidneyInt，2003，63:143-155.

[7]Enomoto A，Kimura H，Chairoungdua A，et a1．Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[J]. Nature，2002，417(6887)：447-452.

[8]Kozl M, Jonson T, Sanna S, et al. Meta-analysis of 2814 individuals identifies common variants within five new loci that influence uric acid concentrations[J]. PLOS Genet,2009,5：e1000504.

[9]Li T, Walsh JC, Ghishan FK, et al. Molecular cloning and characterization of a human urate transporter(hURAT1) gene promoter[J]. Bioch Biophys Acta, 2004,1681:53-58.