★ 林瑤 黃秀榕* 祁明信 黃露芬 郭娜 唐宋文 陳旭征

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福建 福州 350108；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院眼科 福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福建 福州 350108)

老年性白內(nèi)障，中醫(yī)病名為圓翳內(nèi)障，研究表明晶狀體氧化損傷以及由氧化損傷誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是老年性白內(nèi)障形成的主要機(jī)制[1,2]。有報(bào)道雌激素能夠減輕晶狀體氧化損傷程度，抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起一定的防護(hù)作用[3,4]。但是，長(zhǎng)期使用雌激素替代療法(Hormone Replacement Therapy，HRT)有引起子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和陰道出血的風(fēng)險(xiǎn)。富含植物雌激素的植物，如大豆等具有類(lèi)雌激素樣活性，可以替代雌激素并防止雌激素不良反應(yīng)的發(fā)生。

金雀異黃素(Genistein，Gen)是大豆中提取的有效單體，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與雌二醇(β-Estradiol，E2)相似，具有微弱雌激素樣作用，目前對(duì)其在抗腫瘤、治療心血管疾病及防治骨質(zhì)疏松等方面已進(jìn)行了大量深入的研究[5-7]。然而金雀異黃素對(duì)氧化損傷所致的人晶狀體上皮細(xì)胞(Human Lens Epithelia Cell，HLEC)的凋亡是否具有防護(hù)作用，有待研究。本研究擬在復(fù)制實(shí)驗(yàn)性HLEC氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，以E2為陽(yáng)性對(duì)照，采用流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)檢測(cè)HLEC凋亡率和線粒體膜電位(mitochondria membrane potential，ΔΨM)的變化，探討植物雌激素Gen對(duì)氧化損傷的HLEC的防治作用，為尋求防治白內(nèi)障的確切有效藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACS Calibur)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)FORMA 2111)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus IMT-413)、超凈工作臺(tái)(江蘇SW-CJ-IF)、微量移液器(法國(guó)GILSON)、冰箱(青島BCD-268)、超低溫冰箱(日本MDF-V5410)、微量電子天平(上海FA200X)、低速水平離心機(jī)(北京LD4-2)、恒溫水浴鍋(深圳HH-4)、干燥箱(上海101A-2)等。

1.2 主要試劑 金雀異黃素(Genistein, Gen)粉末，純度98%，美國(guó)Sigma公司；E2(β-Estradiol,E2)粉末，純度97%，美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)BD公司；線粒體膜電位檢測(cè)(JC-1)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)，美國(guó)Amresco公司；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium)，美國(guó)Thermo scientific公司；胰蛋白酶(Trypsin)，美國(guó)Gibco公司；新生牛血清(Newborn Calf Serum，NCS)，奧地利PAA公司；磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，美國(guó)Thermo scientific公司；30%H2O2，上海試劑總廠。

1.3 HLEC復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代 采用永生化人晶狀體上皮細(xì)胞B3系(HLEC-B3)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取出保存凍存細(xì)胞的凍存管立即放入37℃水中，將溶解的細(xì)胞懸液用10倍體積以上的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)x心，除上清，反復(fù)洗滌3次。以5×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組與給藥 ①空白對(duì)照組：HLEC+DMEM培養(yǎng)液；②H2O2組：空白對(duì)照組+3×10-4mol/L H2O2；③E2組：H2O2組+1×10-8mol/L E2；④Gen組：H2O2組+1.85×10-5mol/L Gen。

1.5 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化 按上述分組將H2O2以及E2、Gen分別與HLEC共同孵育24h后，收集漂浮及貼壁的細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩遍；取5×105個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5mL Binding Buffer；加入5μl Annexin V-FITC和5μlPI，混勻，室溫避光孵育15min，1小時(shí)內(nèi)于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 FCM檢測(cè)HLEC內(nèi)線粒體膜電位的變化 按上述分組將H2O2以及E2、Gen分別與HLEC共同孵育24h后，收集漂浮及貼壁的細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞；用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩遍；取5×105個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中；加入0.5mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min；在孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液(5X)加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1X)，并放置于冰??；37℃孵育結(jié)束后，600g 4℃離心3～4min，沉淀細(xì)胞，棄上清；用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次：加入1mL JC-1染色緩沖液(1X)重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3～4min，沉淀細(xì)胞，棄上清，共兩次；再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 金雀異黃素對(duì)各組HLEC凋亡率的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)CM結(jié)果顯示:H2O2組HLEC凋亡率顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；E2、Gen組的凋亡率顯著低于H2O2組(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Gen對(duì)H2O2損傷的HLEC凋亡率的影響

注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01，與H2O2組比較，**P<0.01。

2.3 金雀異黃素對(duì)各組HLEC線粒體膜電位的影響 采用JC-1染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位(ΔΨM)，ΔψM正常細(xì)胞JC-1染色后呈紅色熒光(R2區(qū))，而ΔψM下降的細(xì)胞則出現(xiàn)紅色熒光減弱和(或)綠色熒光增強(qiáng)(R3區(qū))。FCM結(jié)果顯示：H2O2組的R3區(qū)細(xì)胞，即ΔψM下降的細(xì)胞比例顯著高于空白對(duì)照組，(P<0.01)；而E2和Gen組的R3區(qū)細(xì)胞比例顯著低于H2O2組(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 Gen對(duì)H2O2損傷的HLEC線粒體膜電位的影響

注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01，與H2O2組比較，**P<0.01。

圖1 Gen對(duì)H2O2損傷的HLEC線粒體膜電位的影響的流式圖

3 討論

本課題組前期研究已表明H2O2是一種活性氧，可誘導(dǎo)HLEC發(fā)生氧化損傷，并引起HLEC的凋亡[8,9]。流行病學(xué)和許多基礎(chǔ)研究均提示雌激素對(duì)氧化損傷的HLEC的凋亡具有防護(hù)作用[3,4]，但長(zhǎng)期使用雌激素副作用較多。植物雌激素，尤其是從豆類(lèi)植物中提取的植物雌激素，可以替代雌激素的作用并同時(shí)降低雌激素不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。前期研究表明植物雌激素可降低氧化損傷的HLEC的凋亡率、提高HLEC線粒體跨膜電位，從而減輕實(shí)驗(yàn)性氧化損傷的HLEC的凋亡程度[10,11]。

金雀異黃素(Gen)是從大豆中提取的一種植物雌激素。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大豆性味甘平，具有健脾補(bǔ)中、潤(rùn)燥消水、排膿解毒、消腫止痛之功效?！堆幽昝劁洝分休d：服食大豆可令人“長(zhǎng)肌膚，益顏色，填骨髓，加氣力，補(bǔ)虛能食”。金雀異黃素是大豆中最主要的活性成分，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與雌二醇相似，能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)，具有雌激素樣作用[12]。雖然其生物效應(yīng)僅相當(dāng)于雌二醇的10-5～10-3，但它在循環(huán)中的濃度能比內(nèi)源性雌二醇高100倍[13]。因此Gen可應(yīng)用于雌激素替代療法，具有安全、廉價(jià)、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期研究已證實(shí)Gen可提高H2O2損傷的HLEC內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性、降低膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，對(duì)實(shí)驗(yàn)性HLEC的氧化損傷具有防護(hù)作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)H2O2組線粒體膜電位較空白對(duì)照組顯著降低，而E2和Gen組線粒體膜電位較H2O2組顯著升高，說(shuō)明H2O2可導(dǎo)致HLEC線粒體損傷，線粒體通透性增加，其膜電位下降；而E2和Gen可保護(hù)被H2O2損傷的HLEC的線粒體膜，升高其膜電位。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各組凋亡率的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H2O2組凋亡率較空白對(duì)照組顯著升高，而E2和Gen組凋亡率較H2O2組顯著下降，提示金雀異黃素作為一種植物雌激素可能發(fā)揮了類(lèi)雌激素的作用，通過(guò)升高H2O2損傷的HLEC的線粒體膜電位，提高了線粒體膜的穩(wěn)定性，減輕了H2O2損傷引起的凋亡程度，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HLEC的凋亡具有防護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為金雀異黃素防治老年性白內(nèi)障提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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