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        過敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠模型的建立與評價*

        2014-08-29 05:45:34史鎖芳周奎龍
        江西中醫(yī)藥大學學報 2014年3期
        關(guān)鍵詞:模型

        ★ 史鎖芳 周奎龍

        (1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇 南京 210029)

        基于已發(fā)表文獻中的造模方法均為單純過敏性鼻炎模型或哮喘模型,本次實驗結(jié)合國內(nèi)外文獻報道,選擇國內(nèi)常用的SD大鼠,在傳統(tǒng)模型制作方法基礎(chǔ)上進行適當改良摸索出一種新的大鼠過敏性鼻炎-哮喘綜合征模型建立方法,現(xiàn)報告如下。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠20只,由南通大學實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2008-0010)。將大鼠按體重采用隨機區(qū)組法分為2組,每組10只。分別為:(1)對照組(193.89±7.17)g;(2)模型組(193.25±14.44)g;具有可比性。

        1.2 試劑與儀器 (1)試劑:卵白蛋白:由上海伯奧生物科技有限公司提供,生產(chǎn)批號(101008)。(2)主要儀器:萊卡切片機(德國Leica公司,型號:RM2128);熒光顯微鏡(日本制造,OLYMPUS型號:BX51);照相機(日本制造,型號:OLYMPUS C-35AD-2);超聲霧化器(德國百瑞公司);自制透明帶蓋塑料盒(50cm×30cm×20cm)等。

        1.3 造模方法 運用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻擊法造模:卵白蛋白腹腔注射14天后,用卵白蛋白連續(xù)鼻部滴注7天,建立模型[1-3]。初次致敏第7天開始用卵白蛋白滴鼻,1次/天,10μL/次。連續(xù)滴鼻7天。之后隔日給予卵白蛋白1g/L滴鼻,以維持對鼻黏膜的刺激。每隔7天觀察一次鼻部滴蛋白液30分鐘內(nèi)搔鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)。采取記分法記錄鼻分泌物量、噴嚏次數(shù)及鼻癢程度。方法如下:(1)鼻涕:流至前鼻孔1分;超過前鼻孔2分;涕流滿面3分。(2)噴嚏:4個以內(nèi)1分;5~10個2分;10個以上3分。(3)鼻癢:輕度抓鼻1分;頻繁抓鼻2分;抓鼻不止3分。自鼻腔激發(fā)開始觀察30分鐘,采用疊加法記分,總分超過5分為動物造模成功。

        從第15日開始,將模型組大鼠置于密閉器皿內(nèi)(自制的50cm×30cm×20cm透明帶蓋塑料盒),給予2%OVA溶液進行霧化吸入;對照組以生理鹽水代替。設(shè)定霧化流量為3 mL/min,每次持續(xù)霧化20min激發(fā)哮喘,觀察大鼠反應,以出現(xiàn)抖毛、毛發(fā)豎立、抓鼻、咳嗽、打噴嚏、腹式呼吸、呼吸急促甚則出現(xiàn)口唇、雙耳紫紺、伸頸、縮胸、點頭運動、抽搐、跌倒、大小便失禁等。待出現(xiàn)癥狀后,隨機從正常組和模型組各取2只作病理切片,模型組較正常組支氣管黏膜及黏膜下層組織有大量的嗜酸性粒細胞浸潤、支氣管壁增厚、平滑肌增生、管腔狹窄、組織黏膜輕度充血水腫等典型的氣道炎癥及重建表現(xiàn),視為造模成功。

        1.4 一般狀況觀測 觀察實驗期間各組大鼠的呼吸頻率、精神、飲食、活動、毛發(fā)、大小便等。

        1.5 標本采集與觀測

        1.5.1 大鼠血樣采集 常規(guī)方法采血后用于血漿各指標的檢測。

        1.5.2 鼻部標本采集 大鼠麻醉處死后,完整切取頭部:部分直接取鼻部標本凍存;部分用中性甲醛固定,取鼻部標本石蠟包埋,行HE染色。

        1.5.3 肺部標本采集 分離主支氣管,打開胸腔,結(jié)扎左側(cè)支氣管,通過主支氣管下管約1cm進行右肺肺泡灌洗,每次注入37%生理鹽水0.6mL,緩慢注入后再緩慢回抽共3次,收集1.35~1.55mL液體為合格,4℃,1 500rpm離心10min,上清于-20℃保存以備相關(guān)因子檢測。肺泡灌洗液的離心沉淀物待進行細胞計數(shù)實驗。左肺留取部分肺組織10%中性福爾馬林和石蠟包埋后進行HE染色病理學檢測。

        2 結(jié)果

        2.1 一般情況 對照組大鼠反應靈敏,未見異常。模型組經(jīng)抗原激發(fā)后張口喘息,腹部翕動,易激惹,躁動不安,抖毛,抓鼻,打噴嚏,甚則出現(xiàn)口唇及雙耳紫紺,飲水量明顯增多,精神萎靡,食量減少,反應遲鈍,活動明顯減少或俯臥不動,毛色發(fā)黃卷曲,枯槁無華。造模后,造模各組大鼠鼻炎癥狀累計積分平均達到5分以上,與正常對照組有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

        表1 造模前后大鼠鼻炎癥狀積分比較

        注:與對照組比較P<0.05。

        2.2 肺泡灌洗液 大鼠模型組白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞的百分比明顯增加,與對照組比較,﹡﹡P<0.01,有顯著的統(tǒng)計學意義。

        表2 造模前后大鼠肺泡灌洗液中細胞總數(shù)及EOS水平

        注:EOS采用瑞氏染色法,與對照組比較,﹡﹡P<0.01。

        2.3 組織病理形態(tài)學的變化(HE染色)

        對照組鼻黏膜及支氣管粘膜上皮完整,細、小支氣管結(jié)構(gòu)正常,未見炎癥細胞浸潤;模型組:支氣管粘膜上皮破壞明顯,上皮細胞有不同程度壞死且有脫落,粘膜下可見大量嗜酸性細胞浸潤,肺泡內(nèi)有少量分泌物及炎性細胞。

        2.3.1 鼻黏膜組織(已切片,HE×40)

        2.3.2 肺組織(已切片.HE×10)

        3 討論

        支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的呼吸道疾病之一,哮喘的發(fā)病率居高不下,據(jù)統(tǒng)計全球約有3億哮喘患者,目前已成為全球公共健康問題[4]。哮喘往往是全身性過敏性疾病的下呼吸道的表現(xiàn),哮喘患者多伴有過敏性鼻炎(allergic rhinitis AR)。目前,AR已影響到10%~25%的世界人口[5],我國兒童AR的患病率為21.9%~38.5%,2009年中國《變應性鼻炎診斷和治療指南》顯示我國中心城市變應性鼻炎的平均患病率為11.1%[6],其中1/3的變應性鼻炎患者會發(fā)展成哮喘。有研究認為,患有AR的患者發(fā)生哮喘的風險是未患有AR的患者的3~6倍,哮喘患者中AR的發(fā)生率為80%左右,大多數(shù)重癥哮喘患者不能達到良好控制的原因也包括AR的處理不規(guī)范。因此,AR是哮喘的一個重要的獨立危險因素,對于伴有過敏性鼻炎的哮喘的治療是我們面臨的一個臨床難題。

        3.1 鼻-肺反射假說[7]如果鼻部疾病引起的分泌物倒流則可刺激咽喉部,從而引起支氣管平滑肌收縮和下呼吸道炎癥;尤其是AR時導致炎癥介質(zhì)直接流向鼻后刺激咳嗽感受器,造成炎癥持續(xù)狀態(tài);持續(xù)釋放的炎癥介質(zhì)可導致支氣管平滑肌的痙攣,使血管通透性增加,炎癥細胞激活并募集于氣道,從而使支氣管炎癥反應表現(xiàn)出級聯(lián)放大的效應。

        3.2 變應性鼻炎和哮喘 AR與哮喘的發(fā)病都與特應性有關(guān),AR和哮喘無論在發(fā)病機制還是病理生理過程都是一致的[8]。變應性鼻炎是接觸過敏原后,由IgE介導產(chǎn)生鼻黏膜炎癥,從而表現(xiàn)出鼻部癥狀的一種疾患。變應性鼻炎和哮喘都是IgE介導的I型變態(tài)反應,兩者的病理學改變都存在著嗜酸性粒細胞的浸潤[9],變應性鼻炎是發(fā)生哮喘的重要而獨立的危險因素。當前“同一氣道,同一疾病”的觀點已經(jīng)被普遍接受,此觀點強調(diào)了變應性鼻炎和哮喘的密切關(guān)系,這一點在變應性鼻炎與哮喘的研究中已經(jīng)充分證實,因而在哮喘的診斷和治療過程中,必須兼顧變應性鼻炎的治療。2009年WHO在日內(nèi)瓦會議上形成并在Journal of Allergy and Clinical Immunology雜志發(fā)表的《重癥哮喘共識》[10]中強調(diào)了變應性鼻炎是哮喘控制的重要影響因素。2010年中華醫(yī)學會呼吸病學會《難治性哮喘診斷與處理專家共識》中同樣指出:變應性鼻炎在難治性哮喘患者中非常常見[11]。在國外進行的一項大規(guī)模變應性鼻炎與哮喘治療的研究中發(fā)現(xiàn):聯(lián)合管理變應性鼻炎與哮喘可顯著降低醫(yī)療費用、改善患者癥狀并提高患者的生活質(zhì)量。

        3.3 合格的動物模型研制,是研究開發(fā)過敏性鼻炎-哮喘綜合征新方法新制劑的基礎(chǔ)和必要條件,檢索文獻,尚未發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎-哮喘綜合征動物模型的建立方法,為此我們進行了初步嘗試。研究表明,氣道慢性炎癥是哮喘的病理學基礎(chǔ),支氣管高反應性(BHR)和肺嗜酸性粒細胞(EOS)炎癥是哮喘的主要特征。嗜酸性粒細胞對于氣道炎癥和氣管高反應性的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系極為密切[12]。本實驗測定過敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠模型BALF中的細胞因子和嗜酸性粒細胞的結(jié)果及組織病理學的觀測與臨床相符,發(fā)病機理相似,可以初步認為此模型制作方法是成功的,有一定的推廣價值。當然,我們應當看到,物種之間的差異性也使得動物模型的局限性不可避免,沒有一個模型能完全具有人類哮喘的特征,提示我們今后要合理利用動物模型。

        [1]趙宇,C.A ndrew vanHasse l t,吳港生,等.卵白蛋白經(jīng)鼻致敏建立變應性鼻炎動物模型[J].中華耳鼻喉頭頸外科雜志,2005,40(3):176-180.

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        [3]余建瑋,薛漢榮,程光宇,等.中醫(yī)寒哮動物模型的建立[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(11):1 755-1 758.

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