， ，b，，，，

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)：a.病理科；b.神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶 400016；2.重慶市日用化學(xué)工業(yè)研究所，重慶 400065)

松油烯4醇是一種存在于多種植物精油中的單萜類化合物，具有多種生物活性。研究發(fā)現(xiàn)含有該種成分的精油具有抗菌、抗炎、除螨、鎮(zhèn)咳、抗氧化、抗腫瘤等活性，已經(jīng)被用于治療口腔潰瘍、牙齦炎、牙根管炎、手足癬以及皮膚感染等疾病，同時(shí)也用作護(hù)膚品的原料，可減少痤瘡引起的紅腫等[1-3]。但目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)松油烯4醇單體的研究還鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)松油烯4醇對(duì)肺癌細(xì)胞株A-549增殖抑制作用及可能的作用機(jī)制的研究為肺癌及其他腫瘤化療提供一個(gè)新的選擇。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人細(xì)支氣管肺泡癌細(xì)胞株 A-549由重慶醫(yī)科大學(xué)病理科惠贈(zèng)；SPF級(jí)BALB/c-nu裸小鼠21只購(gòu)至重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4～5周齡，體質(zhì)量15～19 g，雌雄不限，動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào):SCXK[渝]2007-0001。

1.2 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(HyClone公司)；DMEM 培養(yǎng)基(高糖型，HyClone 公司)；0.25%胰蛋白酶(HyClone公司)；MTT(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；CCK8(碧云天生物技術(shù)研究所)；松油烯4醇(西亞試劑，純度大于或等于98%)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物飼養(yǎng)及藥品配制

將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入青霉素100 U/mL和鏈霉素100 Lg/mL。將細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2孵箱中在飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液1次，每3天以1∶2正常傳代培養(yǎng)1次，采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。裸鼠實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)均在重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫、恒濕的 SPF 動(dòng)物房進(jìn)行，12 h 晝夜節(jié)律，裸鼠可以自由進(jìn)食和飲水。松油烯4醇以11 ul加入5.5 mL培養(yǎng)液中配成0.2%v/v的母液使用時(shí)按比例稀釋成0.02%～0.1% v/v工作液。過(guò)濾除菌分裝后4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制及IC50

將密度為1×104/mL的A549細(xì)胞接種于 96 孔板中過(guò)夜，每孔100 μl，加入含不同濃度油烯4醇(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%v/v)的培養(yǎng)液(200 μl/孔)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/mL用PBS 配制，pH 7.5)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出廢液，每孔加入150 μl DMSO，于60 r/min的搖床中振蕩10 min。在490 nm波長(zhǎng)處用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的光吸收值。計(jì)算抑制率:抑制率=[1-處理組D(490)值/對(duì)照組D(490)值]×100% ，再計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果將A-549細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分為0.04%、0.06%、0.08%(v/v)組分別以含有相應(yīng)濃度的松油烯4醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)。將21只裸鼠按隨機(jī)數(shù)目表隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(0%v/v)、低劑量組(0.06%v/v)、高劑量組(0.08%v/v)。

1.6 CCK-8 比色分析法繪制生長(zhǎng)曲線

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)A-549 細(xì)胞按(每孔1×103)接種于五塊96孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)隔夜貼壁后，加入含松油烯4醇(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%v/v)的培養(yǎng)液(每孔200 μl)，邊緣孔以PBS填充，同時(shí)設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基CCK-8，無(wú)細(xì)胞)，每組設(shè)5復(fù)孔，每隔24 h取出一塊每孔加入10 μLCCK-8溶液，4 h后測(cè)定450 nm各孔的吸光度值，連測(cè)5 d。以時(shí)間為橫軸，每天的吸光度值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用胰酶消化PBS洗滌1次后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到EP管中以1 200 r/min離心10 min。吸棄上清液，沿管壁緩慢加入預(yù)先配制好的固定液，4 ℃保存過(guò)夜后送電鏡室，用 HITACHI-7500透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.8 細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A-549細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的濃度接種于六孔板中。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜貼壁后棄上清，加入無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)液，饑餓同步18 h，使細(xì)胞停滯于G0期。按分組方法分組培養(yǎng)24 h后，收集上清液細(xì)胞；0.25%胰酶-EDTA消化，1 000 r/min離心10 min，收集貼壁細(xì)胞，PBS洗滌2次，1 000 r/m離心10 min。在檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試管中先后加入1×Buffer 100 mL，AV染液5 μL，PI染液1 μL，避光15 min，再加入1×Buffer 400 μL，上機(jī)檢測(cè)；檢測(cè)周期細(xì)胞加入70%冷乙醇在4 ℃固定12 h后在試管中加入1 mL的DNA染色劑，避光30 min，上機(jī)檢測(cè)。用隨機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組重復(fù)3次。

1.9 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A-549細(xì)胞按分組方法分組培養(yǎng)24 h，1 000 r/min，離心5 min。洗滌后，在結(jié)合緩沖液中，加入終濃度為5 μmol·L-1的Flou-3/AM，，置CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后反復(fù)洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm。每組重復(fù)3次。

1.10 BALB/C(nu/nu)裸小鼠體內(nèi)移植瘤建立

將肺癌A-549細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，消化離心收集后，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于99%，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。用帶6號(hào)針頭注射器抽取癌細(xì)胞懸液接種于裸鼠右前腋部皮下，每個(gè)部位接種 0.2 mL(含活細(xì)胞數(shù)1×106個(gè))，接種后每天觀察有無(wú)腫瘤形成及注射點(diǎn)有無(wú)破潰紅腫，經(jīng)過(guò)3～7 d潛伏期，可見(jiàn)接種部位皮下出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，并逐漸長(zhǎng)大，呈圓形或橢圓形突出于體表，以腫瘤直徑0.5 cm為成瘤。

1.11 治療后抑瘤率的測(cè)定

按分組方法將21只裸小鼠按隨機(jī)數(shù)目表隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、高劑量組，以相應(yīng)藥物濃度進(jìn)行腹腔注射給藥，每只每天0.1 mL，治療10 d后脫頸處死，分離瘤組織測(cè)量其長(zhǎng)短徑和重量，移植瘤的體積按公式:V(mm3)=πab2/6計(jì)算。根據(jù)治療結(jié)束后移植瘤瘤質(zhì)量及體積計(jì)算各組平均瘤質(zhì)量及平均瘤體積。通過(guò)各組平均瘤質(zhì)量計(jì)算抑瘤率( inhibition ratio，IR)。IR=(對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 松油烯4醇對(duì)A-549細(xì)胞增殖抑制影響及IC50

不同濃度的松油烯4醇作用A-549細(xì)胞株24 h后，從松油烯4醇濃度0.02%v/v開(kāi)始對(duì)細(xì)胞株的生長(zhǎng)均有抑制作用，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并呈濃度依賴性(圖1)。運(yùn)用SPSS 17.0分析計(jì)算A-549細(xì)胞株24 h的IC50為0.067%v/v。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.01

2.2 不同濃度松油烯4醇對(duì)A-549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

根據(jù)5 d的CCK8結(jié)果來(lái)繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示給藥組生長(zhǎng)曲線明顯較對(duì)照組平緩，表明松油烯4醇對(duì)A-549細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性(圖2)。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.01

2.3 松油烯4醇對(duì)A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察顯示：未用松油烯4醇處理的細(xì)胞可見(jiàn)到少量自噬空泡(圖3a)，松油烯4醇處理24 h后的細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量自噬空泡、擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等(圖3b、c、d)。

a：空白對(duì)照組；b：0.04組；c：0.06組；d：0.08組

圖3不同濃度松油烯4醇作用與A549細(xì)胞后透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變情況

2.4 A-549細(xì)胞周期分布、凋亡、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、細(xì)胞 膜電位水平測(cè)定

2.4.1 A-549細(xì)胞周期分布測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度松油烯4醇處理細(xì)胞24 h后，藥物組與對(duì)照組比較，松油烯4醇能降低A-549細(xì)胞的G1期細(xì)胞的比例，升高G2期和S期細(xì)胞比例，呈現(xiàn)G2期和S期阻滯作用，并呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖4。

2.4.2 肺癌A-549細(xì)胞凋亡檢測(cè) 與空白對(duì)照組相比，經(jīng)藥物處理24 h后的細(xì)胞凋亡的比例均有明顯升高，且晚期凋亡的比例呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表2、圖5。

2.4.3 A-549細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定 不同藥物濃度作用24 h后，各藥物干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均明顯高于正常對(duì)照組，且隨著藥物濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖6。

2.5 松油烯4醇對(duì)肺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

治療結(jié)束時(shí)對(duì)照組移植瘤體積及平均瘤質(zhì)量，見(jiàn)表3、圖7。各組移植瘤平均體積和平均質(zhì)量相互比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。計(jì)算高、低劑量的松油烯4醇對(duì)肺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制率分別為53.33%和77.46%。

表1 松油烯4醇對(duì)A-549細(xì)胞周期的影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.01

a：空白對(duì)照組；b：0.04組；c：0.06組；d：0.08組

分組總凋亡率(%)Ca2+熒光強(qiáng)度對(duì)照組1.18±0.16100.30±12.750.04組8.43±0.51*129.7±0.96△0.06組33.75±0.65*781.78±9.24#0.08組44.32±2.35*1014.2±83.47#

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.01；△：與對(duì)照組比較，P>0.05

a:對(duì)照組；b:0.04%組；c:0.06%組；d:0.08%組

5AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀分析松油烯4醇處理

A-549細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況

a:對(duì)照組；b：0.04組；c：0.06組；d：0.08組

6不同藥物濃度作用于A-549細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變情況

表3 各組裸鼠移植瘤體積、瘤質(zhì)量及抑制率

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.01

a:對(duì)照組;b:低劑量組;c:高劑量組

3 討論

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展帶來(lái)的環(huán)境污染以及吸煙率居高不下等原因，肺癌已成為我國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位[4-5]?；熌壳笆欠伟┨貏e是中晚期肺癌最有效的治療方法之一。然而傳統(tǒng)的肺癌化療藥物常因嚴(yán)重?fù)p害人體正常組織細(xì)胞而使臨床應(yīng)用受到限制[6-7]。人們期望一種既能抗腫瘤，又不過(guò)多損害機(jī)體正常組織的新化療藥物的出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A-549以及BALB/C裸小鼠移植瘤研究了松油烯4醇對(duì)人肺癌的體外及體內(nèi)作用及其機(jī)制。MTT、CCK8以及體內(nèi)抗移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比，松油烯4醇在0.02%～0.1%v/v濃度范圍內(nèi)對(duì)A-549細(xì)胞均有明顯抑制作用，且呈劑量依賴和時(shí)間依賴性的關(guān)系。

細(xì)胞增殖即是細(xì)胞周期循環(huán)的過(guò)程，因此細(xì)胞增殖的抑制既是細(xì)胞周期循環(huán)停滯的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為細(xì)胞群體分布主要與DNA合成活躍的S期有關(guān)，細(xì)胞一旦進(jìn)入此期，如無(wú)特殊干擾，便能按細(xì)胞周期的順序發(fā)展下去，直至重新回到G1期。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期表明，不同濃度松油烯4醇處理細(xì)胞24 h后，藥物組與對(duì)照組比較劑量依賴性的降低G1期細(xì)胞的比例，升高S期細(xì)胞比例，使細(xì)胞呈現(xiàn)S期阻滯。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞程序性死亡功能紊亂有關(guān)。細(xì)胞程序性死亡是指機(jī)體在生長(zhǎng)、發(fā)育以及受到外來(lái)刺激時(shí)清除多余、衰老或受損傷的細(xì)胞以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡和維持正常生理活動(dòng)過(guò)程的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制。正常生命個(gè)體每天有數(shù)以億計(jì)的細(xì)胞誕生，同時(shí)又有數(shù)以億計(jì)的細(xì)胞程序性死亡，兩者處于一種動(dòng)態(tài)平衡，一旦失衡就可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞凋亡和自噬被稱為Ⅰ型和Ⅱ程序性細(xì)胞死亡，目前使用的大多數(shù)化療藥物就是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬而達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞作用的[8-11]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)松油烯4醇具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡和自噬增強(qiáng)的作用。

很多文獻(xiàn)指出，凋亡以及自噬過(guò)程與線粒體有著非常密切的關(guān)系，而線粒體是細(xì)胞內(nèi)的鈣庫(kù)，調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡[12-14]。故本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了藥物處理后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變情況，發(fā)現(xiàn)給藥組Ca2+濃度升高并呈劑量依賴性 ，說(shuō)明在細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中，Ca2+可能也參與其中，并發(fā)揮了一定的作用，但有關(guān)它們之間具體的聯(lián)系還有待進(jìn)一步的研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)松油烯4醇具有抑制人肺癌A-549細(xì)胞增殖的作用，并呈一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，其可以阻止A-549細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，誘導(dǎo)凋亡和自噬的途徑可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載相關(guān)。至于松油烯4醇抑制A-549細(xì)胞增殖阻滯細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)凋亡和自噬的確切機(jī)制仍需后期研究進(jìn)一步證實(shí)。

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