曾 彬，王艾力，彭小凡，李 昌

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢430060;2.中南醫(yī)院心血管內(nèi)科超聲心動(dòng)室，湖北武漢430071;3.武漢大學(xué)2008級(jí)臨床醫(yī)學(xué)五年制2班，湖北武漢430060;4.湖北省中山醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢430033)

隨著對(duì)細(xì)胞移植與基因治療結(jié)合的研究，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)作為外源性治療基因的載體而被關(guān)注［1］。一些研究表明供體細(xì)胞在移植前的基因修飾可使其獲得更高的移植存活率及增強(qiáng)隨后發(fā)揮的綜合生物學(xué)作用。譬如:用抗凋亡基因Bcl-2修飾過(guò)的MSCs可以提高移植MSCs在急性心肌梗死后心肌的生存率，改善左室心肌重塑及左室心功能［2］。然而，對(duì)于局部血流灌注未恢復(fù)的缺血心肌來(lái)說(shuō)，單純提高移植細(xì)胞存活率并沒(méi)有很大的意義，尤其是對(duì)于患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

血紅素氧合酶-1(heme oxygenase，HO-1)是血紅素分解代謝的起始酶和限速酶，能催化血紅素降解為一氧化碳(CO)、亞鐵離子(Fe2+)和膽紅素，后者迅速降解為膽綠素。最近已經(jīng)有研究證明了HO-1在血管再生方面的重要作用［3－4］。然而，MSCs介導(dǎo)的 HO-1是否對(duì)血管再生產(chǎn)生影響仍然不得而知。

1 材料與方法

1.1 MSCs的分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng)和腺病毒轉(zhuǎn)染

無(wú)菌條件下采集16～18周齡 Wistar大鼠的雙側(cè)脛、股骨骨髓，密度梯度法分離 MSCs，以細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)/mL密度接種于塑料培養(yǎng)瓶，DMEM/F12+20%胎牛血清、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至70% ～80%匯合時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基;按感染復(fù)數(shù)值200加入Adv-HO-1(由臺(tái)灣中央研究院李梅芳博士饋贈(zèng)，攜帶綠色熒光蛋白)，37℃孵育2 h加入新鮮的培養(yǎng)基，5% CO2、37℃ 條件下培養(yǎng)［5］。

1.2 心肌梗死模型的制備與細(xì)胞移植及分組處理

給大鼠聯(lián)合20% 烏拉坦(150 mg/kg)與1.5%戊巴比妥(10 mg/kg)腹腔注入麻醉，呼吸機(jī)正壓輔助呼吸;于大鼠左側(cè)第4肋間橫切口開(kāi)胸，暴露心臟，剪開(kāi)心包，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界稍下1～2 mm處用5-0無(wú)損傷線結(jié)扎左冠脈前降支，造成心肌梗死。篩選成功心肌梗死模型大鼠36只，分成3組，每組12只。于大鼠心梗后1 h，直視下于梗死心肌周?chē)梦⒘孔⑸淦鞣?點(diǎn)分別注射HO-1-MSCs，GFP-MSCs(5 × 106個(gè)/100 μL)［5］，關(guān)胸，維持輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù)，送回籠中精心飼養(yǎng)。注射PBS為對(duì)照組。

1.3 Western blot檢測(cè)HO-1蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF2)的表達(dá)

梗死區(qū)周邊心肌組織提取蛋白后電泳分離，轉(zhuǎn)膜，一抗為 HO-1兔抗鼠多克隆抗體，或促凋亡蛋白Bax兔抗鼠多克隆抗體;二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗兔抗體，ECL反應(yīng)溶液底片顯影，掃描底片。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

移植1周后切除大鼠心臟，用試劑盒(Invitrogen公司)從心肌梗死灶周邊區(qū)域提取所有RNA，按照前述方法進(jìn)行 RT-PCR，β-actin為內(nèi)參。Human HO-1的引5'-CAGGCAGAGAATGCTGAGTTC-3'(正義)，5'-GATGTTGAGCAGGAACGCAGT-3'(反義)。反應(yīng)條件β-actin:94℃解鏈，54℃退火，72℃延伸90 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。凝膠掃描分析計(jì)算目的帶A值，以β-actin為參照，計(jì)算相對(duì)A值。

1.5 毛細(xì)血管密度的測(cè)定

移植4周后，取梗死區(qū)周邊組織，制作石蠟組織塊后垂直于其長(zhǎng)軸連續(xù)切片，每隔1 mm切片一張，厚度為6 μm。采用 CD34相關(guān)抗原二步法，先加CD34多克隆抗體，再加通用型二抗，DAB染色，顯微鏡下觀察，控制反應(yīng)時(shí)間在5～10 min，沖洗，蘇木素復(fù)染、水性封片劑封片。每張切片隨機(jī)取5個(gè)200倍視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)毛細(xì)血管的數(shù)目，取平均值即為毛細(xì)血管密度。

1.6 TUNEL染色檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。切片脫臘水化，室溫下30 mL/L甲醇過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min;蛋白酶K(20 mg/L于10 mol/L Tris2 HCl pH 8.0)溶液，37℃消化30 min;加 1 mL/L Triton X2100，4 ℃，8 min;濕盒中樣本上加入TUNEL反應(yīng)液50 μL(1液和2液1∶9混合，用前現(xiàn)配)，37℃，孵育60 min(黑暗處)。樣本上加入Converter-AP，放入濕盒，37℃、30 min;樣本上加入BCIP/NBT顯色液50 μL濕盒中避光顯色5～10 min，甘油封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。(除加Triton X2100外，余每步后均用0.01 mol/LPBS沖洗，3×5 min)。對(duì)照組實(shí)驗(yàn):用不加末端轉(zhuǎn)移酶的作陰性對(duì)照;用DNase預(yù)先消化的作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算每只大鼠心臟10個(gè)切面上心肌梗死區(qū)原位末端染色陽(yáng)性的心肌細(xì)胞核的數(shù)目。顯微鏡放大200倍觀察單個(gè)細(xì)胞核，每個(gè)切片隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野凋亡細(xì)胞核的比例(凋亡細(xì)胞核數(shù)目/總細(xì)胞核數(shù)目)以及6個(gè)視野凋亡細(xì)胞核比例的平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 大鼠心功能的檢查

細(xì)胞移植第7天后常規(guī)做超聲檢查，用高頻探頭，經(jīng)胸前壁于大鼠胸骨左緣用二維切面超聲進(jìn)行檢查，測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular endsystolic dimension，LVDs)，舒張末期內(nèi)徑 (left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)，并計(jì)算左室長(zhǎng)軸縮短率(shortening，F(xiàn)S%)和射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction，EF%)。

1.8 Masson染色檢測(cè)

移植4周后，長(zhǎng)軸中點(diǎn)處垂直于長(zhǎng)軸將左心室一分為二，按標(biāo)準(zhǔn)的病理技術(shù)行甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，行改良Masson三色染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:

2 結(jié)果

2.1 MSCs介導(dǎo)的HO-1體內(nèi)或體外穩(wěn)定表達(dá)

HO-1轉(zhuǎn)染MSCs后體外可觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光蛋白表達(dá)(圖1A);HO-1-MSCs中HO-1的表達(dá)顯著高于Null-MSCs和對(duì)照MSCs(圖1B，C)。移植7 d后，HO-1-MSCs與宿主心臟心肌細(xì)胞匯合(圖1D)。hHO-1 mRNA可以在HO-1-MSCs組的心肌組織樣本中檢測(cè)到，而在Null-MSCs和PBS組卻檢測(cè)不到(圖1E)。

2.2 HO-1-MSCs移植后對(duì)血管再生的影響

圖1 MSCs介導(dǎo)的HO-1體內(nèi)或體外穩(wěn)定表達(dá)Fig 1 HO-1 expression mediated by MSCs in vitro and in vivo(×200)

α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫熒光染色及毛細(xì)血管密度測(cè)定表明，相比于Null-MSC和PBS組，HO-1-MSCs移植可以顯著增加毛細(xì)血管密度;Null-MSCs組毛細(xì)血管密度高于PBS組(圖2A，B)。ZnPP處理后，毛細(xì)血管密度相比MSCs組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A，B)。同樣地，VEGF和 FGF2在 HO-1-MSCs組的表達(dá)也要顯著高于Null-MSCs和ZnPP處理過(guò)的HO-1-MSCs組，其中，后兩者VEGF和FGF2的表達(dá)無(wú)明顯差異(圖2C，D)。

2.3 HO-1-MSCs移植后對(duì)心肌凋亡的影響:

心肌凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HO-1-MSCs組心肌凋亡顯著少于其他組，而 Null-MSCs和ZnPP處理過(guò)的HO-1-MSCs組無(wú)明顯差異。PBS組心肌凋亡數(shù)目明顯多于Null-MSCs和ZnPP處理過(guò)的HO-1-MSCs組(圖3)。

2.4 HO-1-MSCs移植后對(duì)心室功能及心肌纖維化的影響

移植4周后監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。相比PBS組，HO-1-MSCs和Null-MSCs組左室功能明顯提高(圖4A)。圖4B是典型的Masson-Trichome染色后的左心室切片圖。相比于PBS組，HO-1-MSCs和Null-MSCs組發(fā)生心肌纖維化的心肌比例明顯減少(圖4C，D)。

3 討論

細(xì)胞移植治療急性心肌梗死會(huì)出現(xiàn)移植細(xì)胞存活率低的問(wèn)題。研究顯示炎性反應(yīng)的高峰出現(xiàn)在急性心肌梗死后1周，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致供體細(xì)胞死亡的主要原因［6］。雖然許多研究關(guān)注抗凋亡、抗炎性反應(yīng);但血管再生不僅可以提高移植細(xì)胞的存活率而且可以減輕心肌凋亡，恢復(fù)心臟功能。

圖3 HO-1-MSCs移植后對(duì)心肌凋亡的影響Fig 3 Effects of HO-1-MSCs transplantation on apoptosis(×200)

圖4 HO-1-MSCs移植后對(duì)心室功能及心肌纖維化的影響Fig 4 Effects of HO-1-MSCs transplantation on ventricular function and remodeling(×40 100)

MSCs具有分泌促血管再生細(xì)胞因子的潛能。然而移植3周后細(xì)胞數(shù)目明顯減少，6周后幾乎所有移植細(xì)胞都消失［7］。有限存活的MSCs不能達(dá)到最大促血管生成的作用。HO-1具有對(duì)多種細(xì)胞的保護(hù)作用;HO-1提高M(jìn)SCs的生存率，使之發(fā)揮最大的生物學(xué)行為［8］。最近的研究表明HO-1基因在內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)表達(dá)使血管再生明顯增加［9］。 以腺病毒為載體的HO-1注射到缺血的下肢可以促進(jìn)下肢血流的明顯增加，這種作用部分是因?yàn)槊?xì)血管密度增加以及HO-1對(duì)血管生成的作用引起［10］。在本研究中，HO-1-MSCs組心肌梗死周邊區(qū)域毛細(xì)血管密度及血管生成因子(VEGF、FGF2)要明顯高于Null-MSCs組和ZnPP處理過(guò)的HO-1-MSCs組;后兩組毛細(xì)血管密度及VEGF、FGF2的表達(dá)無(wú)明顯差異，表明 HO-1具有促進(jìn)血管再生的作用;證明MSCs介導(dǎo)的HO-1也對(duì)血管再生具有積極作用。曾有報(bào)道NO可能通過(guò)上調(diào)血管細(xì)胞VEGF的分泌來(lái)調(diào)節(jié)血管再生，NO抑制劑可以減少內(nèi)皮細(xì)胞促血管再生作用［11］。CO可能也參與了VEGF的表達(dá)［12］。缺血心肌VEGF表達(dá)的增加可能是促心肌梗死后心肌血管再生的另一個(gè)原因。此外，F(xiàn)GF2也具有促進(jìn)血管再生，調(diào)節(jié)血管細(xì)胞增殖，遷移和分化的潛能［13］。Lin的研究證明，HO-1基因在心肌梗死后心肌表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)VEGF生成，進(jìn)一步促進(jìn)血管再生，對(duì)梗死后心肌起到部分的保護(hù)作用［14］。

血管再生有利于缺血心肌局部血流的恢復(fù)。心肌血供的增強(qiáng)可挽救原本由于心肌缺血丟失或者失去功能的心肌細(xì)胞。本研究中，HO-1-MSCs組凋亡細(xì)胞相比對(duì)照組明顯減少，HO-1-1MSCs組左室擴(kuò)張及纖維化程度均明顯減少，心室腔更小，左室前壁室壁更厚。超聲心動(dòng)圖進(jìn)一步證實(shí)HO-1修飾的MSCs可以明顯提高左室功能。

總之，MSCs介導(dǎo)的HO-1可以促進(jìn)急性心肌梗死后的血管再生，改善心功能。

志謝:感謝Dr.Lee-young Chau慷慨提供Adv-hHO-1以及對(duì)該研究的幫助。

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