， ，

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563003；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610038；3.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院麻醉科，重慶 400038)

肝癌是中國乃至全世界發(fā)病率最高的腫瘤之一[1]，目前手術(shù)切除仍然是治療肝癌最有效的方法。作為人體內(nèi)最大的器官，肝臟本身以及周圍鄰近組織豐富的血運(yùn)，使得肝癌具有較高術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，預(yù)后較差[2]。因此腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是外科醫(yī)生面臨的重大難題。本研究通過對肝癌患者術(shù)中循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的研究，確定肝癌切除手術(shù)是否會增加肝癌患者術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率，為臨床治療方式的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例收集

本研究為開放式研究，選取行手術(shù)治療的肝癌患者為研究對象，以健康志愿者作為對照。記錄所有研究對象的性別、年齡、體質(zhì)量。本研究共納入38名研究對象。肝癌患者18名，男17名(94.4%)，女1名(5.6%)，平均年齡(51.19±12.41)歲，體質(zhì)量(60.81±9.99) kg；健康志愿者20名，男8名(40%)，女12名(60%)，平均年齡為(30.90±7.13)歲，體質(zhì)量(57.43±9.56) kg。

1.2 樣本采集及實(shí)驗(yàn)分組

用無菌抗凝注射器抽取每位研究對象的循環(huán)血。肝癌患者在手術(shù)切皮開始后分別抽取切肝前和切肝后循環(huán)血各20 mL；因本研究納入的所有手術(shù)患者手術(shù)開始的時間均為上午9:00～10:00，故健康志愿者采血時間定為9:00～10:00，每人抽血20 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血液樣本檢測 所有樣本采集離體后即刻4 ℃保存，于24 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。常規(guī)檢測：每例樣本取2 mL進(jìn)行血常規(guī)檢測，主要對白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；取20 μl用牛鮑氏計(jì)數(shù)板進(jìn)行顯微鏡下全血有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。免疫熒光法檢測：每例樣本取2 mL血樣，使用紅細(xì)胞裂解法富集有核細(xì)胞，富集的有核細(xì)胞即刻進(jìn)行細(xì)胞涂片，每例樣本涂片2張，經(jīng)4%多聚甲醛固定后晾干備用。使用熒光抗體CD133標(biāo)記細(xì)胞膜、熒光抗體AE1/AE3標(biāo)記細(xì)胞漿，熒光染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色。染色完成后在多通道、放大倍數(shù)可調(diào)式熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取20個視野計(jì)數(shù)其內(nèi)的所有有核細(xì)胞數(shù)及抗體陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 每例樣本取16 mL血樣在無菌環(huán)境下進(jìn)行密度梯度離心分離富集有核細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液用于細(xì)胞原代培養(yǎng)。培養(yǎng)10～15 d，培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長情況及細(xì)胞克隆成株情況，并記錄克隆株的數(shù)量及形態(tài)。培養(yǎng)結(jié)束后將標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，再進(jìn)行免疫熒光法檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)檢測與有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

比較切肝前后樣本經(jīng)血常規(guī)檢測到的白細(xì)胞數(shù)量和經(jīng)顯微鏡計(jì)數(shù)到的全血有核細(xì)胞數(shù)，肝癌患者切肝后的白細(xì)胞數(shù)上升,切肝后血中的有核細(xì)胞總數(shù)也較切肝前增加(表1)。

表1 切肝前后白細(xì)胞數(shù)及有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

*：與切肝前比較，P<0.01

2.2 免疫熒光檢測結(jié)果

2.2.1 免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)的陽性細(xì)胞有3種表現(xiàn)，分別為AE1/AE3陽性和CD133陰性、AE1/AE3陰性和CD133陽性、AE1/AE3陽性和CD133陽性，3種陽性細(xì)胞在各組樣本中均有發(fā)現(xiàn)(圖1)。

2.2.2 各類陽性細(xì)胞樣本例數(shù)比較 統(tǒng)計(jì)出各組樣本中存在不同陽性細(xì)胞的樣本例數(shù)如表2所示，各類陽性樣本例數(shù)在各組間比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3組AE1/AE3陽性細(xì)胞的總樣本數(shù)為55例(98.2%)，與CD133陽性細(xì)胞樣本總數(shù)10例(17.9%)和雙陽性細(xì)胞的樣本總數(shù)28例(50.0%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=74.137，P<0.001)。

2.2.3 各組陽性細(xì)胞數(shù)比較 由全血有核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和顯微鏡下的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果換算得出每例樣本中各類陽性細(xì)胞的總數(shù)量(公式：陽性細(xì)胞數(shù)=全血有核細(xì)胞計(jì)數(shù)×鏡下觀察到的細(xì)胞涂片上陽性細(xì)胞所占比率)，結(jié)果顯示AE1/AE3陽性細(xì)胞的個數(shù)兩兩比較，對照組與切肝前、后組陽性細(xì)胞數(shù)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，CD133陽性細(xì)胞和雙陽性細(xì)胞數(shù)量在各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

a、b、c、d:AE1/AE3+& CD133-;e、f、g、h:AE1/AE3-& CD133+;i、j、k、l：AE1/AE3+& CD133+

圖1免疫熒光染色陽性細(xì)胞(10×40)

表2 各組樣本存在各類陽性細(xì)胞的樣本[例(%)]

分組AE1/AE3+CD133+雙陽性切肝前0.014±0.0110.007±0.0190.002±0.004切肝后0.007±0.0070.007±0.0200.004±0.011對照組0.024±0.022*0.003±0.0110.009±0.029

*:與切肝前、切肝后比較，P<0.05

2.3 各組細(xì)胞培養(yǎng)克隆生成率比較

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，各組樣本均發(fā)現(xiàn)有克隆株生成(圖2)。比較各組的克隆生成率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.634，P>0.05)。培養(yǎng)后免疫熒光染色結(jié)果提示，各組均發(fā)現(xiàn)抗體陽性表達(dá)的單細(xì)胞，各組發(fā)現(xiàn)的陽性細(xì)胞染色亮度、形態(tài)無明顯差別(圖3)。

圖2 各組樣本細(xì)胞培養(yǎng)克隆生成率

a、b、c、d、e:切肝前；f、g、h、i、j:切肝后；k、l、m、n、o:對照組

3 討論

肝臟是人體內(nèi)最大的實(shí)體器官，門靜脈、肝動脈血液流經(jīng)肝臟經(jīng)肝血竇-肝靜脈匯入下腔靜脈，進(jìn)入體循環(huán)。肝臟組織豐富的血運(yùn)也往往造成肝癌組織體積較大、切除困難，手術(shù)操作對腫瘤組織機(jī)械刺激較多。不排除有腫瘤細(xì)胞因受手術(shù)操作的機(jī)械擠壓而隨肝臟血流進(jìn)入體循環(huán)，造成肝癌的術(shù)后血行性轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能。本研究結(jié)果提示，肝癌患者切肝后白細(xì)胞數(shù)和總的有核細(xì)胞數(shù)均明顯高于切肝前，手術(shù)操作對肝癌患者的白細(xì)胞數(shù)和有核細(xì)胞總數(shù)造成一定影響，可能是由于機(jī)體對手術(shù)所產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。

既往大量研究已經(jīng)證實(shí)，在惡性腫瘤患者循環(huán)血中存在具有增殖特性的腫瘤細(xì)胞[3-7]。Riethdorf等[7]通過一種用于富集和計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)即CellSearch system檢測了92名患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者的外周血，在這些樣本中，發(fā)現(xiàn)循環(huán)血腫瘤細(xì)胞最高達(dá)1 920個/7.5 mL。同時，Cristofanilli等[5]的研究還證實(shí)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量與腫瘤患者預(yù)后有關(guān)，當(dāng)每7.5 mL循環(huán)血液中含有的腫瘤細(xì)胞大于5時，患者的總體生存率要顯著小于每7.5 mL循環(huán)血液含有小于5個腫瘤細(xì)胞的患者。腫瘤細(xì)胞具有自我復(fù)制、更新以及分化的能力[8-9]，與干細(xì)胞特性類似，也有人稱腫瘤細(xì)胞的這種特性為無法控制的自我復(fù)制和更新能力[10]。干細(xì)胞標(biāo)記物CD133已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤的形成相關(guān)，如大腦腫瘤、膀胱癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等[7,11-12]。我國學(xué)者Yin等[13]證實(shí)CD133陽性的肝細(xì)胞性癌癌細(xì)胞具有更高的成瘤活性。肝癌屬于上皮來源的腫瘤，表達(dá)上皮細(xì)胞相關(guān)抗體,即角蛋白抗體[14]。Pantel等[15]的綜述中提到角蛋白抗體CK陽性的腫瘤細(xì)胞更易表達(dá)多種特異性癌基因，并且比CK陰性的腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。AE1/AE3的生物效能相當(dāng)于CK1-CK7、CK10、CK14-CK16、CK19，并且在大鼠、小鼠、人、靈長類動物等多種生物體內(nèi)的上皮細(xì)胞中表達(dá)[16-17]。因此，本研究選取CD133和AE1/AE3標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。AE1/AE3和CD133均為陽性的雙陽性細(xì)胞表示該細(xì)胞為來源于上皮細(xì)胞的干細(xì)胞，具有明顯的腫瘤干細(xì)胞特性，因此，我們把這類細(xì)胞歸為高危細(xì)胞。只單獨(dú)表達(dá)AE1/AE3或CD133的細(xì)胞為無分化增殖能力的肝癌細(xì)胞、正常上皮類細(xì)胞或者正常組織的干細(xì)胞，因此，這兩類細(xì)胞成為相對安全細(xì)胞。

本研究免疫熒光法檢測結(jié)果提示，在肝癌患者循環(huán)血中發(fā)現(xiàn)有AE1/AE3和CD133均表達(dá)的雙陽性細(xì)胞，說明在肝癌患者血液中存在有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs，circulating tumor cells)；同時細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果提示肝癌患者無論是切肝前循環(huán)血還是切肝后循環(huán)血，均培養(yǎng)有克隆株形成。說明肝癌患者血液中存在的CTCs具有自我復(fù)制增殖的能力，這可能是肝癌患者術(shù)后仍有高復(fù)發(fā)率的原因。比較各類陽性細(xì)胞在2組樣本中的數(shù)目發(fā)現(xiàn)，肝癌患者切肝前后并無差別，并且CD133陽性及雙陽性的細(xì)胞數(shù)目在所有實(shí)驗(yàn)組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果也提示，肝癌患者術(shù)中切肝后血液培養(yǎng)并不比切肝后血液培養(yǎng)更易形成克隆株，并且形成克隆株的樣本病例的腫瘤來源、腫瘤病理類型及分化程度在兩組間也無明顯區(qū)別。這說明手術(shù)操作并不影響肝癌患者循環(huán)血AE1/AE3陽性、CD133陽性及雙陽性細(xì)胞的數(shù)量。也就證明肝癌切除手術(shù)并不會對肝癌患者血液中的CTCs造成影響，手術(shù)操作本身不會增加肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的概率。免疫熒光法檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，存在AE1/AE3陽性細(xì)胞的樣本總例數(shù)多于存在CD133陽性細(xì)胞和雙陽性細(xì)胞的樣本總例數(shù)，說明健康人血液中即存在有大量的上皮類細(xì)胞。健康志愿者循環(huán)血中的AE1/AE3陽性細(xì)胞數(shù)量多于肝癌患者術(shù)中切肝后的循環(huán)血AE1/AE3陽性細(xì)胞數(shù)量。因此，本研究推測，腫瘤可能會影響血液中正常上皮細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致其數(shù)量減少。

對于健康人群循環(huán)血中的腫瘤細(xì)胞，本研究的結(jié)果與既往研究并不一致。Allard等[3]的研究證實(shí)循環(huán)血腫瘤細(xì)胞僅存在于惡性腫瘤患者的循環(huán)血液中，而不存在于非腫瘤患者及健康人循環(huán)血液中。而本研究的免疫熒光法檢測結(jié)果則發(fā)現(xiàn)，健康人群循環(huán)血液中存在一定數(shù)量的AE1/AE3和CD133雙陽性的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量范圍分別為0～6.5×107/mL、0～1.3×107/mL。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩組樣本中均有克隆株生成，然而免疫熒光染色并未發(fā)現(xiàn)抗體表達(dá)強(qiáng)陽性的同源多核細(xì)胞克隆株，故推測這可能為成纖維類細(xì)胞分裂增殖所形成。因此，對于健康人群血液中的CTCs，還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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