王四海 郭 楨 張秀敏 韓培天 溫塘芳 王 樹(shù)

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院心胸外科，河北 宣化 075100)

大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠肺組織過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫酶的影響※

王四海 郭 楨1張秀敏 韓培天 溫塘芳 王 樹(shù)2

(河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院心胸外科，河北 宣化 075100)

目的研究大黃酚(chrysophanol，Chry)對(duì)腦缺血再灌注(IR)后小鼠肺組織中過(guò)氧化氫(H2O2)及過(guò)氧化氫酶(CAT)的影響，探討大黃酚對(duì)腦IR后對(duì)肺損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法取昆明種小鼠80只，3.5%水合氯醛麻醉后，制備小鼠IR模型。將造模成功的74只小鼠隨機(jī)分為5組，藥物組(IR+Chry)45只，分為高、中、低劑量3個(gè)組，各15只，模型組15只，假手術(shù)組14只。藥物組于缺血前30min 分別腹腔注射大黃酚10.0、1.0、0.1mg/kg；模型組于缺血前30min 腹腔注射溶劑10mL/kg；假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)，但不進(jìn)行腦IR，腹腔注射溶劑10mL/kg。模型組和藥物組小鼠恢復(fù)血供后10min快速斷頭處死，取肺組織，制成10% 肺組織勻漿，測(cè)定小鼠肺組織中H2O2含量和CAT活力。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肺組織內(nèi)H2O2含量明顯增加(P<0.05)，肺組織內(nèi)CAT活力明顯降低﹙P<0.05)；與模型組比較，高劑量大黃酚組小鼠肺組織內(nèi)H2O2含量明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，高劑量大黃酚組小鼠肺組織內(nèi)CAT活力明顯提高(P<0.01)。結(jié)論大黃酚對(duì)腦IR肺損傷的保護(hù)作用可通過(guò)提高肺組織中CAT活力起作用。

腦缺血再灌注；肺臟損傷；過(guò)氧化氫；過(guò)氧化氫酶；大黃酚

大黃酚(chrysophanol，Chry)為大黃的有效成分之一，有研究表明Chry對(duì)腦缺血再灌注(IR)所致小鼠記憶功能損傷有明顯的保護(hù)作用[1]，但關(guān)于Chry對(duì)腦IR引起肺損傷的保護(hù)作用報(bào)道少見(jiàn)。我們擬通過(guò)采用小鼠短暫性腦缺血模型觀察Chry對(duì)腦IR后小鼠肺組織中過(guò)氧化氫(H2O2)含量及過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活力變化的影響，探討Chry對(duì)腦IR所致肺損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病引起的肺組織損傷的保護(hù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠80只，體質(zhì)量 (28±2)g，雌雄不拘，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所提供，許可證號(hào)：(京)2004200012。

1.1.2 藥物與試劑 大黃酚(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥98%，批號(hào)110796-200412)，實(shí)驗(yàn)前用N，N-dimethyl-Formamide溶解，聚山梨酯-80助溶，0.9%氯化鈉注射液稀釋至所需濃度。N，N-dimethyl-Formamide∶聚山梨酯-80∶0.9% 氯化鈉注射液為1∶1∶8。CAT可見(jiàn)光試劑盒及H2O2試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 儀器 FSH-2內(nèi)切式組織可調(diào)高速勻漿器(江蘇大地自動(dòng)化儀器廠)；LabTech全自動(dòng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；二列六孔電熱恒溫水浴鍋(北京精科華瑞儀器有限公司)；Sigma3K30高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 3.5%水合氯醛(10mL/kg，腹腔注射)麻醉小鼠，仰臥位固定，自胸骨柄到下頜骨間行5～8mm正中縱向切口，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，分離后用液體石蠟浸泡過(guò)的黑色手術(shù)線穿過(guò)左右二側(cè)頸總動(dòng)脈，盡量恢復(fù)兩側(cè)頸總動(dòng)脈到原位，黑色手術(shù)線在氣管上方打松反手結(jié)，結(jié)的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側(cè)頸總動(dòng)脈上方的黑線上穿過(guò)一條用液體石蠟浸泡過(guò)白色手術(shù)線，按文獻(xiàn)[2]方法埋線后縫合切口。術(shù)后48h將頸下部黑色手術(shù)線拉緊，阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)，5min后輕拉兩側(cè)白色手術(shù)線，使頸總動(dòng)脈恢復(fù)血液再灌注[1]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 造模成功74只，術(shù)后48h將清醒、活動(dòng)正常的造模成功的74只小鼠隨機(jī)分為5組，藥物組(IR+Chry)45只，分為高、中、低劑量3個(gè)組各15只，于缺血前30min 分別腹腔注射大黃酚10.0、1.0、0.1mg/kg；模型組15只，于缺血前30min 腹腔注射溶劑10mL/kg；假手術(shù)組14只，進(jìn)行手術(shù)，但不進(jìn)行腦IR，腹腔注射溶劑10mL/kg。

1.2.3 小鼠肺組織內(nèi)H2O2含量及CAT活力的測(cè)定 模型組和藥物組小鼠恢復(fù)血供后10min快速斷頭處死，在0.9%氯化鈉注射液冰塊上迅速取肺組織，4℃ 0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干，置于1mL離心管內(nèi)，并置于Forma-86c ULT 冰柜內(nèi)冷凍貯存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出制成10% 肺組織勻漿，3500～4000r/min，-4℃低溫離心10min后取適量上清液測(cè)定H2O2含量和CAT活力。每mg組織蛋白每s分解1μmol的H2O2的量為一個(gè)CAT活力單位。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織中H2O2含量比較 見(jiàn)表1。

組 別n劑量(mg/kg)H2O2假手術(shù)組14-39．1±9．8模型組15-51．0±10．2?高劑量大黃酚組1510．022．3±6．7△中劑量大黃酚組151．049．2±10．2低劑量大黃酚組150．150．8±13．1

與假手術(shù)術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01

由表1可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較模型組小鼠肺組織內(nèi)H2O2含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙P<0.05)；與模型組比較高劑量大黃酚組小鼠肺組織內(nèi)H2O2含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 各組肺組織中CAT活力比較 見(jiàn)表2。

組 別n劑量(mg/kg)CAT假手術(shù)組14-10．5±4．2模型組15-6．3±3．1?高劑量大黃酚組1510．011．5±5．0△中劑量大黃酚組151．05．4±4．1低劑量大黃酚組150．16．1±1．5

與假手術(shù)術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.01

由表2可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較模型組小鼠肺組織內(nèi)CAT活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較高劑量大黃酚組小鼠肺組織內(nèi)CAT活力明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

在IR的臨床治療過(guò)程中，患者在接受治療后缺血的腦組織得到再灌注，可引起能量代謝障礙及缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)元缺血性死亡。腦缺血和缺血性再灌注可引起胞內(nèi)Ca2+超載、細(xì)胞膜功能受損，毒性自由基產(chǎn)生，腦能量耗竭，興奮性氨基酸(EAA)釋放增加及細(xì)胞腫脹、凋亡和壞死等。腦IR導(dǎo)致的腦組織缺血、缺氧可引起缺血期原發(fā)性損傷及再灌注期繼發(fā)性損傷[3]。尋找有效的腦缺血疾病預(yù)防和治療藥物，在病理早期防治損傷進(jìn)一步擴(kuò)大，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外腦缺血疾病治療學(xué)研究的重點(diǎn)課題。

IR會(huì)嚴(yán)重影響肺功能，甚至引起肺功能障礙，再灌注損傷發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)是缺血、缺氧，由此啟動(dòng)腫瘤壞死因子(TNF)、花生四烯酸代謝產(chǎn)物如血栓素A2(TXA2)、白三烯B4(LTB4)等以及超氧化基團(tuán)(ROIs)等因子合成和釋放的增加。這些因子除獨(dú)立發(fā)揮各自生物學(xué)功能外，還可相互影響、互為因果，引起血小板、白細(xì)胞聚集、脫顆粒及生物膜磷脂過(guò)氧化反應(yīng)，大分子物質(zhì)降解，釋放血管活性物質(zhì)，增加血管通透性，升高肺血管阻力。參與再灌注損傷的這些因子將炎癥、活性氧基團(tuán)及排異反應(yīng)融合貫穿在一起，缺血再灌注對(duì)肺功能的影響，也是這3個(gè)主要方面共同作用的結(jié)果。因此，對(duì)IR損傷病理過(guò)程的研究和認(rèn)識(shí)，有利于采取和加強(qiáng)針對(duì)性預(yù)防措施，提高肺保護(hù)質(zhì)量，為改善肺功能提供可靠的保證。

CAT是H2O2催化分解成氧和水的酶，存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物體內(nèi)。H2O2是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶，約占過(guò)氧化物酶體酶總量的40%。H2O2是活躍的強(qiáng)氧化劑，能通過(guò)氧化反應(yīng)破壞細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生一系列新的氧化性活躍物質(zhì)—自由基，而CAT是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶，能夠消除細(xì)胞新陳代謝的副產(chǎn)物— H2O2。本研究結(jié)果表明，Chry可增強(qiáng)腦IR小鼠肺組織中CAT活性，促進(jìn)H2O2分解，減少肺組織中H2O2含量，進(jìn)而減少氧自由基的生成及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提示Chry可減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，提高機(jī)體抗氧化酶的活性。有學(xué)者研究后認(rèn)為，Chry對(duì)離體小鼠過(guò)氧化脂質(zhì)有明顯的抑制作用[4]，進(jìn)一步提示Chry減少自由基對(duì)肺組織損傷、增強(qiáng)肺組織中CAT活力是其保護(hù)腦IR引起肺損傷的重要機(jī)制之一。

[1] 王樹(shù)，張丹參，張力，等.大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護(hù)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29(15)：1934-1936.

[2] Himori N，Watanabe H，Akaike N，et al.Cerebral ischemia model with conscious mice：involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability[J].J Pharmacol Meth，1990，23：311-327.

[3] 韓敏，劉艷凱，薛茜.腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，23(5)：75-78.

[4] 李超，張丹參，趙曉倩，等.三種大黃酚制劑改善腦缺血/再灌注小鼠記憶功能的實(shí)驗(yàn)篩選研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(12)：1607-1612.

(本文編輯：董軍杰)

Effectsofchrysophanolonhydrogenperoxideandcatalaseinlunginjuryinducedbycerebralischemiareperfusionofmice

WANGSihai*,GUOZhen,ZHANGXiumin,etal.

*DepartmentofCardiothoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Hebei,Xuanhua075100

ObjectiveTo study the effects of chrysophanol on hydrogen peroxide and catalase in lung injury induced by cerebral ischemia reperfusion in mice and further analyze the related mechanisms of protective effect on lung injury induced by cerebral ischemia reperfusion.MethodsCerebral ischemia reperfusion models of mice were prepared with 90Kunming mice anesthetized by 3.5% chloral hydrate.The models of 74mice that prepared successfully were randomly divided into five groups: sham-operated group(14mice, operate but not do cerebral ischemia reperfusion ), model group(IR, 15mice, operate and do cerebral ischemia reperfusion), high dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 10mg/kg), middle dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 1mg/kg), low dose chrysophanol group(IR+Chry, 15mice, ip 0.1mg/kg).Mice of model group and chrysophanol group were beheaded quickly when blood flow is restored after ten minutes, and then lung tissues were taken out of beheaded mice to make 10% lung homogenate.H2O2and CAT activities in lung were measured.ResultsCompared with sham-operated group, the content of H2O2of model group was increased, and the activities of CAT was decreased, and there were statistical differences﹙P<0.05)；Compared with model group, Chrysophanol could decrease the content of H2O2(Chry10.0, Chry1.0mg/kg，P<0.01)and increase the activities of CAT(Chry10.0mg/kg，P<0.01) in lung of mice induced by cerebral ischemia reperfusion.ConclusionProtective effects of chrysophanol on lung injury of cerebral ischemia reperfusion can be affected by increasing the activity of CAT in the pulmonary tissue.

Cerebral ischemia reperfusion；Lung injury；Hydrogen peroxide；Catalase；Chrysophanol

※ 項(xiàng)目來(lái)源：張家口市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：1221015D)

王四海(1970—)，男，副主任醫(yī)師，碩士。從事多器官損傷保護(hù)研究工作。

R-332；R284.1；R563.02；R619.901

A

1002-2619(2014)10-1546-03

2014-05-13)

1 河北省宣化縣新型農(nóng)村合作醫(yī)療管理辦公室，河北 宣化 075100

2 河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000