孫寧寧，高 祥，李玲霞，宋麗娜，李曉鷗，王子健，劉 寧*，武利濤

(1.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院，吉林 長春130041； 2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院；3.吉林省腫瘤醫(yī)院；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科)

腫瘤是由多重因素引起的復(fù)雜疾病，受多種基因的調(diào)控?；虻谋磉_(dá)方式錯(cuò)綜復(fù)雜，從mRNA表達(dá)水平并不能準(zhǔn)確預(yù)測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)的動態(tài)修飾和加工并非必須受基因序列的調(diào)控。而且蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的真正執(zhí)行者，可以動態(tài)反映生物系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞的形成必然涉及蛋白質(zhì)組的變化。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤生物標(biāo)記物具有重要的意義。其核心研究思路是通過分析腫瘤細(xì)胞/組織等樣品中的蛋白質(zhì)組，尋找腫瘤患者與正常人的蛋白質(zhì)組的異同。所采取的技術(shù)方法-基于雙向電泳—質(zhì)譜(MS)分析的技術(shù)-具有精確、靈敏、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于腫瘤生物標(biāo)記物的研究。本文主要對近年來基于雙向電泳—質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法在研究蛋白類腫瘤生物標(biāo)記物方面進(jìn)行綜述。

1 腫瘤生物標(biāo)記物的主要類型

腫瘤的生物標(biāo)記物(該文中的腫瘤生物標(biāo)記物特指蛋白類腫瘤生物標(biāo)記物)主要有3類：腫瘤特異抗原、腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤引起的自身抗體[1,2]，它們產(chǎn)生于腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中。腫瘤特異抗原是腫瘤所特有的抗原，在正常細(xì)胞中不存在。腫瘤相關(guān)抗原在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中都存在，在相同條件下，蛋白類腫瘤相關(guān)抗原在腫瘤患者與健康人體內(nèi)可能會存在表達(dá)量的差異，而且在腫瘤生長的不同時(shí)期也可能會存在表達(dá)量的差異。腫瘤引起的自身抗體為腫瘤相關(guān)抗原導(dǎo)致機(jī)體免疫產(chǎn)生的自身抗體[3]。因而，自身抗體可以作為探針研究腫瘤相關(guān)抗原[4]。在腫瘤早期異常蛋白豐度極低，如果該蛋白引起體液免疫應(yīng)答，則會產(chǎn)生相對過量的抗體并存在于血液中，便于檢測[5]，所以自身抗體對腫瘤的診斷會更為靈敏[6]?？傊?，它們都可以作為腫瘤的生物標(biāo)記物表征檢驗(yàn)者的患病系數(shù)或患病程度等指標(biāo)。

2 基于雙向電泳—質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法

雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的膠分離技術(shù)，它是將等電聚焦電泳與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及分子量的不同，將大量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)。凝膠染色后的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向表示蛋白以等電點(diǎn)分離的結(jié)果，而垂直方向表示蛋白組以分子量分離的結(jié)果。雙向電泳具有較高的分辨率，可用于比較細(xì)胞或組織在不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)組的變化[7-10]。經(jīng)雙向電泳分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可以通過質(zhì)譜對其進(jìn)行鑒定，也可以對蛋白質(zhì)的翻譯后修飾進(jìn)行表征。

3 基于雙向電泳—質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法在蛋白類腫瘤生物標(biāo)記物研究中的應(yīng)用

目前，已有多種方法應(yīng)用于腫瘤生物標(biāo)記物的研究，如免疫組織化學(xué)技術(shù)、細(xì)胞免疫技術(shù)、膠分離技術(shù)、蛋白芯片、質(zhì)譜等。其中，基于雙向電泳—質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法借助其快速、靈敏、精確的優(yōu)勢，在腫瘤生物標(biāo)記物的研究中得到了廣泛的應(yīng)用[11,12]。

3.1應(yīng)用于腫瘤特異抗原研究的主要技術(shù)路線

該技術(shù)路線(圖1 (A))主要通過雙向電泳的方法分離蛋白質(zhì)組，從而發(fā)現(xiàn)腫瘤特異抗原。首先，將腫瘤與正常組織或細(xì)胞進(jìn)行樣本處理，獲得蛋白樣品。通過蛋白定量確定樣品濃度進(jìn)行雙向電泳，即首先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行等電聚焦電泳(IEF)，使蛋白質(zhì)定位于pH梯度膠條的特定位置，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量不同進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使同一等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)由于分子量不同而得到分離。雙向電泳凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌x擇合適的染色方法，如Blue silver、銀染、鋅染等。直接染色的凝膠經(jīng)掃描獲得蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，通過分析軟件比較實(shí)驗(yàn)組與對照組的異同，尋找異常蛋白點(diǎn)。然后將差異蛋白斑點(diǎn)取出，進(jìn)行膠內(nèi)酶切及肽段提取，最后使用質(zhì)譜方法檢測肽段信息。質(zhì)譜儀所得到的肽段信息可以通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。如果與所研究肽段的氨基酸序列完全匹配，則該蛋白未經(jīng)修飾，為已知蛋白；否則可通過多肽圖譜的峰值變化判定所研究的蛋白為修飾的已知蛋白或一種新的蛋白質(zhì)。

Giribaldi G等人采用該技術(shù)路線分析方法，發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌潛在的生物標(biāo)記物—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白1(RCN1)[13]。首先，通過2-DE和MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)的檢測，發(fā)現(xiàn)RCN1在所有的腫瘤樣本中都過量表達(dá)。然后通過Western Blot 及免疫組織化學(xué)的方法驗(yàn)證了這一結(jié)論，對以后腎細(xì)胞癌的深入研究及臨床診斷的應(yīng)用作出了貢獻(xiàn)。

和平[14]等人采用以上路線研究肺腺癌生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)94 ku葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(grp94)等6種差異蛋白，為以后尋找肺腺癌特異性腫瘤生物標(biāo)記物提供參考。

3.2應(yīng)用于腫瘤相關(guān)抗原及自身抗體研究的主要技術(shù)路線

僅從技術(shù)方面來看，該技術(shù)路線與檢測腫瘤特異抗原的方法相似，但這兩種方法在本質(zhì)上存在很大的差異(圖1 (B))。該技術(shù)路線主要使用免疫學(xué)的方法研究腫瘤生物標(biāo)記物。與上述路線的不同之處是將未經(jīng)染色的凝膠轉(zhuǎn)膜后，使用病人血清進(jìn)行免疫印跡(Western Blot)， 分析實(shí)驗(yàn)組與對照組的蛋白特征。如果實(shí)驗(yàn)組(腫瘤組織/細(xì)胞提取液)顯示具有差異蛋白點(diǎn)，則可將該膜切割取點(diǎn)，提取的蛋白進(jìn)行酶消化后質(zhì)譜分析。但是，蛋白經(jīng)過免疫印跡多步處理后，蛋白會部分損耗，而且膜經(jīng)過封閉液處理后，切取的膜會帶有相對過量的雜蛋白(封閉液中的蛋白)，這必然會影響質(zhì)譜分析結(jié)果。所以，目前獲取該差異蛋白往往取自直接染色的凝膠，即與實(shí)驗(yàn)組平行的雙向電泳(其中一塊膠用于Western Blot，另一個(gè)用于直接染色)，最后切取與膜上相對應(yīng)的凝膠蛋白斑點(diǎn)。

現(xiàn)在，很多科研工作者使用血清蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究腫瘤相關(guān)抗原及自身抗體。Hamrita B[15]等人通過上述主要路線研究乳腺癌，肯定了血清蛋白質(zhì)組學(xué)用于腫瘤相關(guān)抗原及自身抗體研究的可行性。通過分析比較實(shí)驗(yàn)組與對照組，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)潛在的腫瘤相關(guān)抗原，并且首次鑒定了乳腺癌患者血清中存在抗Prx-2的自身抗體。

(A)研究腫瘤特異抗原的技術(shù)路線；(B)研究腫瘤相關(guān)抗原及自身抗體的技術(shù)路線

當(dāng)然，以上述兩條主線為基礎(chǔ)，還可以設(shè)計(jì)更加完善的研究方法:①樣本來源：樣本來源不一定僅僅來源于組織/細(xì)胞或血清，已有科研工作者證明機(jī)體的血漿、唾液、尿液等都可用于篩選自身抗體[16]。②在樣品處理階段：a樣品進(jìn)行標(biāo)記，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性，比如同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記[17-19]等。b樣品使用免疫法去除無關(guān)及豐度高的雜蛋白，從而提高蛋白分離效果，尤其是低豐度蛋白的分離效果。③試驗(yàn)階段：樣品可以不斷免疫剝離實(shí)驗(yàn)組與對照組的相同抗原，最后進(jìn)行雙向電泳分析差異性；樣品或處理過的樣本也可以直接進(jìn)行酶消化質(zhì)譜鑒定。④實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證階段：比如Western Blot、免疫組織化學(xué)方法及ELISA等。

例如，陳炯[20]等人聯(lián)合熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)與質(zhì)譜分析，鑒定出蛋白質(zhì)補(bǔ)體C3可能是胰腺癌早期潛在的血清特異性生物標(biāo)記物，并應(yīng)用Western Blot的方法驗(yàn)證了這一結(jié)論。

又如，Marie Grandjean[19]等人在血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一種新的方案—順序免疫剝離—2D-DIGE方法。 他們通過研究NMRI鼠結(jié)直腸癌生物標(biāo)記物，驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下的免疫原蛋白，同時(shí)分析比較了血清蛋白質(zhì)組學(xué)方法與順序免疫剝離—2D-DIGE方法。通過兩種分析方法的比較，發(fā)現(xiàn)在某些方面順序免疫剝離—2D-DIGE方法優(yōu)于血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，比如在非變形條件下發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，減少抗原多樣性以及有利于低豐度蛋白的富集等優(yōu)點(diǎn)。為以后腫瘤生物標(biāo)記物的研究提供了新的研究方案。

參考文獻(xiàn)：

[1]Batchu RB,Gruzdyn O,Potti RB,et al.MAGE-A3 With Cell-Penetrating Domain as an Efficient Therapeutic Cancer Vaccine[J].JAMA surgery,2014.

[2]Dai L,Lei N,Liu M,et al.Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in human hepatocellular carcinoma (HCC)[J].Exp Hematol Oncol,2013,2(1):15.

[3]Arlen M,Arlen P,Wang X,et al.The Clinical Detection of Pancreatic Carcinoma:A Comparison of the Standard Biomarkers to that of a Newer Class of Biomarkers used for both Diagnosis and Therapy[J].Pancreatic Dis Ther S,2013,4:2.

[4]Zhu Q,Liu M,Dai L,et al.Using immunoproteomics to identify tumor-associated antigens (TAAs) as biomarkers in cancer immunodiagnosis[J].Autoimmunity reviews,2013,12(12):1123.

[5]Tjalsma H,Schaeps R M J,Swinkels D W.Immunoproteomics:From biomarker discovery to diagnostic applications[J].PROTEOMICS-Clinical Applications,2008,2(2):167.

[6]Martin K,Ricciardelli C,Hoffmann P,et al.Exploring the immunoproteome for ovarian cancer biomarker discovery[J].International journal of molecular sciences,2011,12(1):410.

[7]Wang Y,Jiang Y R,Qin L.Using 2D-PAGE and Mass Spectrometry (LC-MS/MS) for Embryo Proteins Analysis in Antheraea pernyi[J].Advanced Materials Research,2014,884:556.

[8]Lange S,Rosenkrands I,Stein R,et al.Analysis of protein species differentiation among mycobacterial low-Mr-secreted proteins by narrow pH range Immobiline gel 2-DE-MALDI-MS[J].Journal of proteomics,2014,97:235.

[9]Lam S W,Jimenez C R,Boven E.Breast cancer classification by proteomic technologies:Current state of knowledge[J].Cancer treatment reviews,2014,40(1):129.

[10]Srikanth R.Mass spectrometry-based proteomics in molecular diagnostics:Discovery of cancer biomarkers using tissue culture[J].BioMed research international,2013.

[11]Wang Y,Kuramitsu Y,Tokuda K,et al.Proteomic analysis indicates that overexpression and nuclear translocation of lactoylglutathione lyase (GLO1) is associated with tumor progression in murine fibrosarcoma[J].ELECTROPHORESIS,2014.

[12]Zhang W,Wei Y,Ignatchenko V,et al.Proteomic profiles of human lung adeno and squamous cell carcinoma using super‐SILAC and label‐free quantification approaches[J].Proteomics,2014.

[13]Giribaldi G,Barbero G,Mandili G,et al.Proteomic identification of Reticulocalbin 1 as potential tumor marker in renal cell carcinoma[J].Journal of proteomics,2013,91:385.

[14]和 平,李少民,朱雯瑾.蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選肺腺癌相關(guān)蛋白[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版),2013,34(6).

[15]Hamrita B,Chahed K,Kabbage M,et al.Identification of tumor antigens that elicit a humoral immune response in breast cancer patients' sera by serological proteome analysis (SERPA)[J].Clinica Chimica Acta,2008,393(2):95.

[16]Dudas S P,Chatterjee M,Tainsky M A.Usage of cancer associated autoantibodies in the detection of disease[J].Cancer Biomarkers,2009,6(5):257.

[17]Wu J Y,Cheng C C,Wang J Y,et al.Discovery of Tumor Markers for Gastric Cancer by Proteomics[J].PloS one,2014,9(1):e84158.

[18]Huang H,Li Y,Liu J,et al.Screening and identification of biomarkers in ascites related to intrinsic chemoresistance of serous epithelial ovarian cancers[J].PloS one,2012,7(12):e51256.

[19]Grandjean M,Dieu M,Raes M,et al.A new method combining sequential immunoaffinity depletion and differential in gel electrophoresis to identify autoantibodies as cancer biomarkers[J].Journal of immunological methods,2013,396(1):23.

[20]陳 炯,武 文,湯厚闊,等.胰腺癌患者血清的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其意義[J].中華外科雜志,2013,51(001):62.