張紅裔，金 虎，戴春雷，李 丹，翟春亮，王中會(huì)，李亞剛

(吉林大學(xué)第四醫(yī)院·一汽總醫(yī)院，吉林 長春130011)

縮膽囊素(CCK)是一類廣泛分布于消化系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性多肽,在消化系統(tǒng)中可調(diào)控胃酸和胰酶分泌、胃排空等生理過程[1,2]。依據(jù)介導(dǎo)的生理功能不同,CCK 受體被分為 CCK-1(主要分布在消化系統(tǒng))和CCK-2(主要分布在 CNS)兩種亞型。CCk受體的作用是受FGF19拮抗的，F(xiàn)GF19是在餐后1-2 h引起膽囊舒張，F(xiàn)GF19和CCK的交替作用引起膽囊的舒張和收縮。TGR5是G蛋白偶聯(lián)受體，受初級及次級膽汁酸激活，與FGF19一起作為近距離和遠(yuǎn)距離兩個(gè)機(jī)制共同調(diào)節(jié)膽囊的餐后的再充盈，膽囊的運(yùn)動(dòng)障礙是膽囊膽固醇結(jié)石形成原因之一，糖尿病病人 CCK受體受損導(dǎo)致膽囊收縮力減弱及膽囊的過度充盈，無疑會(huì)導(dǎo)致膽囊運(yùn)動(dòng)障礙，膽汁淤積，從而使膽固醇結(jié)晶析出，結(jié)石形成。本實(shí)驗(yàn)通過前瞻性病例對照研究，探討糖尿病病人膽囊膽固醇結(jié)石的成因。

1 臨床資料

1．1一般資料

對照組：獲取正常膽囊組織標(biāo)本時(shí)間相對較長，這些標(biāo)本作為很好的對照，它們是從那些沒有膽道及肝臟疾病的病人行腹部手術(shù)時(shí)獲得，手術(shù)同樣也是標(biāo)準(zhǔn)的膽囊切除術(shù)。有下列之一者排除在外：①B超檢查膽囊結(jié)石、膽囊息肉、急性或慢性膽囊炎等膽囊疾患；②膽管結(jié)石、急性或慢性胰腺炎：③糖尿病病人；④迷走神經(jīng)切斷術(shù)及胃大部切除(畢Ⅰ及畢Ⅱ)術(shù)等上腹手術(shù)史；⑤近期曾使用過可能會(huì)影響膽囊收縮的藥物，如紅霉素、膽酸鈉、生長抑素。

膽固醇結(jié)石組積及膽色素結(jié)石組(病理組)：收集2001年6月-2003年1月我院肝膽外科腹腔鏡膽囊切除術(shù)55例，其中膽囊膽色素結(jié)石患者(實(shí)驗(yàn)組)20例；膽囊膽固醇病變患者19例。入選條件①術(shù)后病理證實(shí)膽囊膽固醇及膽色素結(jié)石；②無癥狀或僅有輕微癥狀的膽囊結(jié)石患者；③無明顯的膽絞痛和急性膽囊炎發(fā)作史；④不合并有膽囊息肉、膽囊惡性病變等；⑤無膽囊結(jié)石嵌頓；⑥無膽總管結(jié)石；⑦無急或慢性胰腺炎；⑧無迷走神經(jīng)切斷、胃大部切除等上腹手術(shù)史；⑨近期未曾使用過可能會(huì)影響膽囊收縮的藥物，如紅霉素、膽酸鈉、生長抑素等等。

1.2標(biāo)本的采集

①術(shù)前由同一超聲診斷醫(yī)師測定膽囊排空功能，術(shù)中取出膽囊，取膽汁1 m1及頸部膽囊壁組織，分別置于無菌管內(nèi)，于30 min內(nèi)置于-70℃冰箱保存。②膽囊標(biāo)本采?。簭挠心懩仪谐m應(yīng)癥的手術(shù)中獲得新鮮的膽囊組織標(biāo)本。病人信息見表1.標(biāo)本隨機(jī)獲取，膽固醇結(jié)石的膽囊組織標(biāo)本和膽色素組織標(biāo)本獲取的比例同流行病學(xué)的比例大致相同。當(dāng)膽囊切除后后立即剪下1.0 cm×1.0 cm 大小全層膽囊壁組織2-3 塊,用無菌生理鹽水沖洗3遍后裝入 Eppendorf 管,立即置入小型手提式液氮罐中,30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室,置于零下85℃低溫冰箱冷凍持續(xù)恒溫保存待測。

2 材料與方法

2.1方法

2.1.1 膽囊排空功能測定 受檢者禁食8-12 h后行超聲檢查，凍結(jié)后用同時(shí)觀察膽囊內(nèi)有無膽汁淤積、結(jié)石形成及膽垂壁是否粗糙。脂肪餐是用花生油25-30 g煎雞蛋兩個(gè)．讓受試者于10 min內(nèi)進(jìn)食完，餐后1、2、3、4 h分別測膽囊大小，在手術(shù)前，使用超聲分別在餐前和餐后不同時(shí)段對膽囊的最大長度、寬度和直徑進(jìn)行測量。應(yīng)用彩色超聲 Mindray DC-8/DC-8，超聲的探頭從右側(cè)肋間隙進(jìn)入，排除結(jié)腸氣體的干擾，選擇正確的角度以獲得膽囊的最大的直徑，測得數(shù)據(jù)后應(yīng)用Dodds’[1]公式測量膽囊體積：V=π/6xL×W×D?？崭贵w積用V0表示，餐后2 h膽囊體積用V2表示，膽汁排泄量使用如下公式計(jì)算EV= V0- V2。餐后2 h的膽囊排空指數(shù)GBEF=(V0-V2)/V0×100%。

2．2RT-PCR測定CCK的表達(dá)

分別從實(shí)驗(yàn)組和對照組取膽囊平滑肌標(biāo)本，提取標(biāo)本、擴(kuò)增、凝膠電泳，以觀察CCK-A、 TGR5、 FGF19及其表達(dá)。

2.2.1 藥品與試劑 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) i.組織中總RNA的提?。孩購囊旱腥〕瞿懩医M織，用剪刀迅速剪取組織放入 1.5 ml 的DEPC水處理過的 Eppendroff 管中，每25-50 mg的組織中加入 500 μl Trizol，用研磨棒研磨組織使Trizol與其充分接觸。②室溫靜置 5-10 min，以充分裂解組織。③加入100 μl 三氯甲烷，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s后室溫靜置2-3 min。④ 4℃，12 000 g，離心15 min，此時(shí)可觀察到管中分三層：下層為紅色的氯仿相，中間為白色的薄層，上層為無色的水相(約占總體積的50%)，小心將上層水相移入一個(gè)新的 1.5 ml 的DEPC水處理過的 Eppendroff 管中，注意不要吸入水相以外的溶液。⑤加入與上層水相等體積的異丙醇，輕輕混勻后，室溫靜置10 min，然后4℃ ， 12 000 g，離心10 min，離心后，棄去上清，留下沉淀。⑥加入 1 ml 75%乙醇(用DEPC水現(xiàn)配)以清洗 RNA 沉淀，溫和震蕩 離心管懸浮沉淀，4℃，7 500 g，離心5 min，然后盡量棄去清洗液。⑦室溫放置 5-10min 以干燥 RNA 至半透明狀。⑧DEPC 水溶解 RNA，加30 μl，一般加(30-100 μl)反復(fù)輕輕吹打若干次，然后放于55-60℃的水浴鍋中水浴 10 min。取1 μl充分溶解后的 RNA 溶液，檢測其 OD260/OD280 比值，計(jì)算出RNA 濃度。ii.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)：①反應(yīng)體系：樣本RNA (1 μg/μl) 5 μl；5×RT Buffer 8 μl; Oligo dT-Adaptor Primer(125 ng/μl) 2 μl ;dNTP Mixture(10 mM) 2 μl;RNase Inhibitor 0.3 μl;MMLV Reverse Transcriptase(200 U/μl) 1 μl;RNase Free ddH2O 41.7 μl;Total 40 μl。②反應(yīng)條件：42℃ 1 h;70℃ 10 min;4℃ 5 min;反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物放置-20攝氏度。iii.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):①反應(yīng)體系：2 的反應(yīng)產(chǎn)物(RT產(chǎn)物) 4 μl;上游引物(10 mM) 1 μl;下游引物(10 mM) 1 μl;2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl;dd H2O 6.5 μl;Total 25 μl。人CCKR 引物：上游引物：GCGTGGTGCGAATGTTGC；下游引物：CAGCCTGTTGGTCAGAGGTATG;片段長度：827 bp，退火溫度：58℃;人 FGF19 mRNA:上游引物：CTCGGAGGAAGACTGTGCT;下游引物：TGGAGGGATTTGGGAAGG;片段長度：832 bp，退火溫度：56℃; 人TGR5 引物：上游引物：5‘-GGCAAGCCTCATCATCACC-3’;下游引物：5‘-CGGGCAGACTGGCAAAGA-3’;片段長度：356 bp， 退火溫度：60℃。②反應(yīng)條件：

iv.取 5 μl 3的產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，凝膠成像分析儀分析結(jié)果。

瓊脂糖凝膠電泳:①稱取 0.15 g瓊脂糖倒入小錐形瓶中，再量取15 ml的1×TAE倒入其中，混勻。②微波爐中加熱1 min至完全溶解，，室溫下冷卻至 60℃左右(期間可以把膠模準(zhǔn)備好)，加入 7.5 μlEB(溴化乙錠)，終濃度為 0.5μg/ml，充分混勻。③將混勻的凝膠緩慢倒入已準(zhǔn)備好的插有梳子的膠模中，凝膠的厚度在 3-5 mm 之間。注意不要產(chǎn)生氣泡。若產(chǎn)生氣泡則迅速用槍頭刺破。④室溫放置 30 min左右，待膠完全凝固后，小心拔出梳子，注意用力要均勻，以免破壞上樣孔。⑤將凝膠小心放入水平電泳槽，倒入電泳緩沖液， 液面應(yīng)高出凝膠表面 2 mm左右。⑥按設(shè)計(jì)好的順序每孔加入 5 μl PCR 產(chǎn)物和DL-2000 Marker。⑦蓋好電泳槽蓋，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至 100 V，時(shí)間 25-30 min。⑧電泳結(jié)束后，取出凝膠，放到凝膠成像分析儀中，觀察結(jié)果，拍照保存，并進(jìn)行灰度值分析。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果利用spss13軟件，對非配對的組間值采用 t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析，變量間相互關(guān)系采用雙變量線性相關(guān)分析。

3 結(jié)果

膽囊排空功能統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果及CCK-A 、TGR5及FGF19受體mRNA的擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：

表1是各組膽囊不同時(shí)段的膽囊的容積值，餐后2小時(shí)達(dá)到最大收縮，表2是組間各變量值。糖尿病病人的膽固醇結(jié)石組膽囊排空能力與正常膽囊組及無糖尿病膽色素組相比較，明顯低于正常膽囊組及無糖尿病組，差異有顯著性。無糖尿病膽色素結(jié)石組與正常膽囊組相比較,低于對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示膽色素結(jié)石成因與膽固醇結(jié)石成因機(jī)制不同。其糖尿病膽固醇結(jié)石組組CCK受體 mRNA 相對表達(dá)量，明顯低于正常膽囊對照組及無糖尿病膽色素結(jié)石組。無糖尿病膽色素結(jié)石組膽囊CCK受體 mRNA與及正常膽囊對照組相比較,低于對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用雙變量線性相關(guān)分析法分析組內(nèi)各變量間相互關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石患者中的膽囊平滑肌細(xì)胞膜 CCK 受體 mRNA 表達(dá)與膽囊殘余指數(shù)，二者呈負(fù)相關(guān)，而膽囊的餐前最大充盈與TGR5及FGF19呈正相關(guān)關(guān)系。

表1 空腹及餐后各時(shí)段膽囊容積

表2 組間各變量值

(注：EV2：餐后2小時(shí)的膽囊膽汁排泄量。GBEF2：餐后2小時(shí)膽囊排空指數(shù)。GBEF4：餐后4小時(shí)膽囊排空指數(shù))

4 討論

膽囊結(jié)石的成因復(fù)雜，膽囊收縮力的減低，膽囊內(nèi)膽汁淤積有利于結(jié)石的形成。在長期禁食超過3個(gè)月的完全腸外營養(yǎng)的患者中有超過45%的成人和43%的兒童發(fā)生膽囊結(jié)石，這說明膽囊動(dòng)力障礙可能是膽囊結(jié)石形成的重要因素之一。膽囊結(jié)石病人膽囊收縮功能障礙的機(jī)制雖然尚未闡明，但有研究表明膽囊壁CCK-A受體數(shù)量的減少可能是膽囊結(jié)石病人中膽囊收縮功能受損的致病環(huán)節(jié)之一[3]。膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)最初發(fā)現(xiàn)于胃腸道，并作為胃腸激素調(diào)節(jié)胰腺的生長和分泌以及胃和膽囊的收縮功能CCK一方面直接參與糖尿病的發(fā)生，通過引起糖尿病而促進(jìn)膽囊結(jié)石的發(fā)生，另一方面CCK及其受體本身異常也導(dǎo)致了膽囊結(jié)石形成。CCK在血液循環(huán)中有4種不同長度的肽鏈形式：CCK-8、CCK-33、CCK-39、CCK-5，其中以CCK-8的生理效應(yīng)最大，其生物學(xué)效應(yīng)通過膽囊平滑肌表面的CCK受體實(shí)現(xiàn)，本組研究表明糖尿病合并膽囊結(jié)石的CCK-受體 mRNA 表達(dá)明顯低于正常病人組，結(jié)石無糖尿病組接近正常病人的表達(dá)，CCK—受體 mRNA表達(dá)與糖尿病合并膽固醇結(jié)石的膽囊排空能力呈正相關(guān)，這在基因水平上支持CCK受體在膽囊結(jié)石形成中的重要作用。罹患膽固醇結(jié)石的患者因?yàn)槠銫CK受體減少而至膽囊收縮功能受損，膽汁中脫氧膽酸含量增加，腸肝循環(huán)減慢，促進(jìn)膽汁中膽固醇增加，最后達(dá)到過飽和。膽固醇含量增高、粘蛋白分泌和脫氧膽酸鹽增加，促使膽固醇結(jié)晶的析出，從而逐漸形成膽囊結(jié)石。膽固醇結(jié)晶析出，進(jìn)而進(jìn)一步形成結(jié)石，這與目前的相關(guān)研究結(jié)果一致[4-6]。Fridhandler在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到40%的土撥鼠在膽囊結(jié)石形成前，膽囊的收縮就已經(jīng)發(fā)生了改變；結(jié)石形成后，收縮減弱者達(dá)65%。膽囊收縮力的減弱與膽囊對CCK及乙酰膽堿的最大反應(yīng)不相關(guān)，說明在成石過程中膽囊收縮的減退是結(jié)石形成的因素，而不是結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)等通過檢測膽石癥患者術(shù)后2 周的血漿CCK-8 水平基本恢復(fù)正常,這也說明了在去除負(fù)反饋源后,CCK的合成、分泌趨于正常，說明膽囊平滑肌上的受體表達(dá)減少負(fù)反饋引起血中的CCK-8的升高。膽囊CCK受體的破壞是由于膽汁中膽固醇過多或由于膽固醇在膽囊壁內(nèi)平滑肌的分泌沉積，當(dāng)膽囊平滑肌暴露于富含膽固醇的環(huán)境時(shí)，膽固醇可通過擴(kuò)散和胞飲作用，進(jìn)入膽囊平滑肌細(xì)胞，并與之結(jié)合。高濃度膽固醇產(chǎn)生細(xì)胞膜毒性作用，影響細(xì)胞膜上CCK受體的正常表達(dá)，導(dǎo)致CCK生理效應(yīng)減低，從而導(dǎo)致膽囊收縮力障礙。傅華群等[2]等證實(shí)了膽固醇可影響CCK受體的調(diào)節(jié)，膽囊膽固醇結(jié)石形成的機(jī)制中亦包括膽道及膽囊膽固醇分泌。亦有研究分析造成膽囊膽固醇結(jié)石形成原因可能是:①膽囊黏膜黏液分泌過多使得膽囊管的阻力增加,造成膽汁排空障礙[7]②當(dāng)膽囊平滑肌長期暴露于富含膽固醇的環(huán)境中,膽固醇可通過擴(kuò)散和胞吞作用進(jìn)入膽囊平滑肌細(xì)胞膜而[8]與之結(jié)合,這種擴(kuò)散具有濃度依賴性。高濃度膽固醇產(chǎn)生細(xì)胞膜毒性效應(yīng),影響肌細(xì)胞膜上的 CCK受體[9]表達(dá),從而導(dǎo)致 CCK生理效應(yīng)的減低。但膽囊結(jié)石到目前為止，其發(fā)病的機(jī)制尚不完全清楚，除了“膽囊內(nèi)膽汁膽固醇過飽和、成核”理論和“ 膽固醇磷脂泡”理論外，近年來的研究日益重視膽囊的病理改變在膽固醇結(jié)石形成中的作用，認(rèn)為膽石的形成并不完全依賴于膽汁物理化學(xué)方面的改變，膽囊自身尤其是膽囊收縮功能在膽固醇結(jié)石的形成中起著非常重要的作用。動(dòng)脈壁游離膽固醇沉積導(dǎo)致Ca離子的內(nèi)流及外流受限，從而使血管平滑肌細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低同時(shí)收縮運(yùn)動(dòng)功能減弱。膽囊平滑肌的膽固醇微泡結(jié)合并扣押CCK受體從而達(dá)到減弱膽囊收縮力的作用，而非毒性作用，CCK受體的總數(shù)沒有改變，只是相當(dāng)一部分CCk受體不能發(fā)揮作用，而且這種失效是可逆的。最新研究顯示除了膽囊收縮功能障礙，膽囊的過度充盈同樣是膽囊膽固醇結(jié)石形成的因素之一?？崭鼓懩殷w積與膽囊結(jié)石本研究通過超聲觀察實(shí)驗(yàn)對象中空腹膽囊體積變化及膽囊收縮比率，結(jié)果表明，空腹膽囊膽固醇結(jié)石組實(shí)驗(yàn)?zāi)懩殷w積擴(kuò)大，膽囊收縮率明顯低于空腹正常對照組，差異有顯著性。說明膽囊體積擴(kuò)大，膽囊收縮功能降低可能與膽囊平滑肌功能缺陷有關(guān)。膽石患者的空腹膽囊體積增大，收縮率下降，膽汁在膽囊內(nèi)淤積時(shí)間相對較長，為結(jié)石產(chǎn)生提供了條件。膽固醇除膽固醇代謝紊亂外還可通過膽堿能受體、CCK受體及Ca2+通道等影響膽囊動(dòng)力，促進(jìn)膽固醇結(jié)石形成。 TGR5是G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞表面受體由初級膽汁酸和次級膽汁酸激活，激活順序是致石膽酸(LCA)>去氧膽酸>鵝去氧膽酸>膽酸[10]。研究表明，有兩個(gè)機(jī)制控制膽囊的充盈，一個(gè)是遠(yuǎn)距離調(diào)控機(jī)制，F(xiàn)GF15/19由回腸的膽汁酸引發(fā)，代表遠(yuǎn)距離信號調(diào)控機(jī)制引起餐后的膽囊的再充盈。另一個(gè)是近距離信號調(diào)控機(jī)制，TGR5受局部膽汁酸濃度影響調(diào)整膽囊的餐后充盈。TGR5通過膽囊上皮纖維跨膜調(diào)節(jié)引起氯離子濃度升高，從而調(diào)節(jié)膽囊的充盈[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病人的膽囊TGR5表達(dá)明顯高于正常膽囊及非糖尿病人，且與膽囊的過度充盈呈正相關(guān)性，F(xiàn)GF19在糖尿病病人膽囊的表達(dá)與正常膽囊組織的表達(dá)差別顯著，而與無糖尿病患有膽囊結(jié)石的膽囊之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們得出可能的結(jié)論是，在膽汁酸腸肝循環(huán)中，膽汁酸在回腸末端被吸收時(shí)能刺激腸細(xì)胞分泌FGFl9．經(jīng)門靜脈循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，進(jìn)而對膽汁酸合成進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，主要是通過對肝臟膽汁酸合成關(guān)鍵酶——膽固醇7α羥化酶起到負(fù)反饋抑制作用，使膽汁酸池減少，從而使TGR5分泌增加，進(jìn)一步導(dǎo)致膽囊的過度充盈，膽固醇晶體析出，結(jié)石形成。未來進(jìn)一步研究可能會(huì)揭示TGR5 和FGF15/19是如何相互協(xié)調(diào)控制膽囊餐后充盈。

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