趙 鑫,劉玉俠,常 穎,王啟文*,盧衛(wèi)平, 王 寶,于 鴻

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長(zhǎng)春130012)

本實(shí)驗(yàn)以肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1作為靶細(xì)胞，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cell，CIK)對(duì)其的殺傷效果，為CIK臨床應(yīng)用治療肺腺癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1試劑細(xì)胞培養(yǎng)液IMDM，購(gòu)于上海立菲生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞因子IFN-γ，上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；IL-1α，peprotech公司；anti-hunman CD3，Biolegend公司；IL-2，北京四環(huán)生物制藥有限公司;FCS，北京元亨;MTT購(gòu)自Sigma ;anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE,購(gòu)自 BD公司。

1.2肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1 吉林省腫瘤防治研究所提供。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備低溫高速離心機(jī)，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃公司；流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.4方法

1.4.1 人外周血單核細(xì)胞的獲取 用吉林省腫瘤防治研究所提供的紅細(xì)胞裂解液[1]分離，提取人外周血單核細(xì)胞后，用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.2 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo) 將以上提取的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)1天后，觀(guān)察無(wú)細(xì)菌污染后，加入IFN-r，再培養(yǎng)1天后，加入anti-humanCD3、IL-1α、IL-2 等細(xì)胞因子，培養(yǎng) 3天后分瓶，同時(shí)補(bǔ)加IL-2。

1.4.3 CIK細(xì)胞的鑒定 將培養(yǎng)第10天的CIK細(xì)胞用0.9%生理鹽水洗滌，計(jì)數(shù)(1×106/ml)，分別用FITC標(biāo)記的CD3Ab、PE標(biāo)記的CD16、CD56Ab對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，冰上孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞中CD3+CD16+CD56+細(xì)胞的表達(dá)

1.4.4 肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1的培養(yǎng) 將在液氮中凍存的SPC-A-1復(fù)蘇后用含10%IMDM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至生長(zhǎng)旺盛期，用0.25%胰酶消化，用IMDM培養(yǎng)液洗滌后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/ml，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,100 μl/孔。

1.4.5 CIK細(xì)胞對(duì)SPC-A-1殺傷活性 將培養(yǎng)的CIK細(xì)胞分為兩組計(jì)數(shù)，第1組細(xì)胞數(shù)為2.5×106/ml，第2組細(xì)胞數(shù)為1.25×106/ml，按以下步驟加入到已接種SPC-A-1的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔，每組設(shè)6復(fù)孔。第1組：SPC-A-1對(duì)照；第2組：CIK1對(duì)照(2.5×106/ml)；第3組：CIK2對(duì)照(1.25+106/ml)；第4組；CIK1+SPC-A-1(50∶1)；第5組 CIK2+SPC-A1(25∶1)。培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT，用酶標(biāo)儀在292 nm處測(cè)OD值。

1.4.6 殺傷活性測(cè)定方法 殺傷活性=[(1- 實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值)/靶細(xì)胞OD值]×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1CIK細(xì)胞鑒定結(jié)果如圖1。從圖中標(biāo)定的結(jié)果可以看出，CD3+CD16+CD56+的標(biāo)記率較高，達(dá)到了74.3%，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞CIK數(shù)量較多。

圖1 CIK細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.2CIK細(xì)胞對(duì)SPC-A-1細(xì)胞殺傷活性，見(jiàn)表1。

3 討論

目前，生物治療已經(jīng)成為惡性腫瘤繼手術(shù)、化療、放療后的第四大治療方式。由于生物治療對(duì)身體無(wú)傷害，可以提高機(jī)體的免疫功能，對(duì)微小轉(zhuǎn)移病灶具有一定的清除作用，同時(shí)能改善病人的生活質(zhì)量，所以在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。

表1 CIK細(xì)胞對(duì)SPC-A-1細(xì)胞殺傷活性

※P<0.05 與1∶25CIK2相比

本實(shí)驗(yàn)選取生物治療細(xì)胞中的一種細(xì)胞-CIK細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀(guān)察其對(duì)肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1的體外殺傷作用，為臨床應(yīng)用提供理論參考。

CIK細(xì)胞(cytokine-induced killer)因其具有NK細(xì)胞的非特異性殺傷作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性無(wú)MHC限制的特點(diǎn)[5]，以及強(qiáng)大的T淋巴細(xì)胞的抗瘤活性[6]，也被稱(chēng)為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞免疫方面發(fā)揮著重要作用[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外不同細(xì)胞因子組合，誘導(dǎo)出了具有高表達(dá)CD3+CD16+CD56+的CIK細(xì)胞，并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證CIK細(xì)胞對(duì)肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1殺傷活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在CIK與SPC-A-1比率為50∶1時(shí)殺傷率可達(dá)70%，說(shuō)明CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)大殺傷力。而且通過(guò)不同數(shù)量的CIK與SPC-A-1比率殺傷活性的比較證明，殺傷活性隨著CIK細(xì)胞數(shù)量的增加，具有對(duì)腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷能力(50∶1>25∶1，P<0.05)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示我們，在臨床應(yīng)用時(shí)一定要達(dá)到細(xì)胞數(shù)量，才能保證甚至提高治療效果。

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