漆正宇，龔英浩

(1. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518036；2.病毒基因工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100052；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025)

人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)為2005年首次報(bào)道的一種感染人呼吸道的細(xì)小病毒[1]，是人支氣管炎的一種病原體[2,3]。細(xì)小病毒外觀呈球形無包膜的正20面體，直徑大約20-25 nm[4]。HBoV基因組為單鏈DNA，全長(zhǎng)大約5.6 kb，主要編碼的蛋白有NS1、NP-1、VP1、VP2等[1]。其衣殼蛋白包括VP1和VP2，VP1基因包含5’端的獨(dú)有區(qū)(unique region of VP1，VP1-U)序列和3’端的VP2序列，是一個(gè)典型的重疊基因[1]。一般而言，細(xì)小病毒VP2是占病毒衣殼95%的主要蛋白，而VP1蛋白N端的VP1-U在病毒感染入胞中有重要意義[5]。本研究表達(dá)純化有活性的HBoV VP1-U蛋白抗原，為臨床免疫診斷方法的建立及蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PMSF溶液 PMSF粉末0.174 g溶解于10 ml異丙醇，1.5 mlEP管分裝，-4℃保存。

1.1.2 蛋白純化溶液體系 10×buffer 1：Tris堿粉末1.21 g溶解于50 ml H2O中，然后加入NaCl 14.61 g，加H2O到95 ml體積，滴加0.1 M HCl調(diào)節(jié)pH=7.9，補(bǔ)充H2O至總體積為100 ml。5×buffer 2：Tris 0.61 g溶于50 ml H2O，再加入NaCl 14.61 g和C3H4N213.62 g，加H2O至95 ml，0.1 M HCl調(diào)節(jié)pH=7.9，補(bǔ)加H2O到總體積為100 ml。buffer A： buffer 1中加入至CH5N3·HCl，CH5N3·HCl終濃度為6 M。7.5 M的CH5N3·HCl。0.1 M的NiSO4。

1.1.3 菌株和培養(yǎng)基 大腸桿菌BL21(DE3)株為本室保存。細(xì)菌增菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基。LB分選固體平板為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂糖，高壓滅菌后，添加相應(yīng)篩選抗生素鋪板，室溫冷卻成固體平板培養(yǎng)基。

1.1.4 各種工具酶和試劑 各種限制性內(nèi)切酶和Ex-Taq PCR反應(yīng)體系(Takara)； T4 DNA Ligase連接酶體系(NEB)；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(Geneaid)； DNA提取試劑盒(Qiagen)； pGEM○R-T Easy載體TA克隆試劑盒(Promega)； BCATMProtein Assay Kit蛋白純化試劑盒(PIERCE)。引物由上海生工公司合成。親和層析柱HiTrapTM 1 ml Chelating HP(Amersham)。

1.2 方法

1.2.1 VP1-U蛋白抗原性分析 用DNAStar Protean軟件分析VP1-U蛋白抗原性，初步了解VP1-U段在VP1中的抗原性強(qiáng)弱。

1.2.2 HBoV VP1-U密碼子改造 HBoV VP1-U DNA序列在大腸桿菌中表達(dá)的會(huì)有一些大腸桿菌不偏愛的稀有密碼子，在http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/上在線分析，得到稀有密碼子的分布情況。使用Vector NTI 9軟件針對(duì)大腸桿菌密碼子頻率初步改造VP1-U DNA，改造后氨基酸序列與原序列一致。

1.2.3 重組表達(dá)載體pET30a(+)/VP1-U的構(gòu)建 采用pET30a(+)為載體在大腸桿菌中克隆表達(dá)重組蛋白。密碼子改造好的VP1-U在DNA 5’和3’端分別附帶NdeI(CA^TATG)和XhoI(C^TCGAG)限制酶序列，交上海生工公司合成。TA克隆序列后，構(gòu)建到pET30a(+)載體上，測(cè)序鑒定。

1.2.4 VP1-U蛋白表達(dá)純化 制備上柱樣品：在含kalamycin的500 ml LB培養(yǎng)基中37℃搖菌至OD600 0.4-1；IPTG 1.5 mM誘導(dǎo)表達(dá)2 h(經(jīng)IPTG梯度濃度和分時(shí)抽樣確定此最佳條件)；蛋白提取全過程程4℃低溫操作，每1 h加入終濃度為1 mM的蛋白酶抑制劑PMSF；離心收集菌液，約20 ml buffer 1洗滌一次；超聲破碎后高速離心30 min，棄上清，沉淀用5 ml buffer A重懸，室溫放置3 h以充分溶解包涵體；高速離心1 h，上清過0.22 μm濾器成上柱樣品。樣品上柱純化順序：依次5倍柱體積純水和buffer 1洗柱，2倍柱體積0.1 M NiSO4上柱(上鎳)；5倍柱體積buffer 1和buffer A洗柱；上樣，buffer A洗樣至無峰；20 ml buffer A分多次(5次以上)梯度攙兌buffer 1洗柱，直至洗柱液buffer A經(jīng)梯度攙兌最終被替換為純buffer 1，且洗至無峰；buffer 2洗脫，收集峰值洗脫液即為目的蛋白液。超濾換液純化蛋白：加2 ml洗脫峰液入3 kD截流超濾管，7500×g離心6 h，期間每小時(shí)補(bǔ)充一次buffer 1至超濾管液體為2 ml。純品VP1-U蛋白進(jìn)行SDS-PAGE不連續(xù)電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后判斷純化結(jié)果，并BCA定量。

2 結(jié)果

2.1 VP1-U蛋白抗原性分析

DNAStar軟件分析結(jié)果顯示，VP1-U蛋白具有較強(qiáng)的抗原性、親水性和表面概率。

圖1 VP1-U蛋白抗原性分析

2.2 VP1-U DNA改造后的序列

我們檢測(cè)編碼CZ688的HBoV病毒株VP1-U DNA序列按照大腸桿菌密碼偏愛優(yōu)化改造如圖2。

圖2 VP1-U密碼子優(yōu)化改造后的序列

2.3 VP1-U表達(dá)純化

樣品穿過鎳柱的吸光度最高峰為105，收集吸光度75～105間急速上升和下降時(shí)的洗脫液，超濾換液。純化過程中各步驟樣品檢測(cè)SDS-PAGE不連續(xù)電泳圖(圖3)，純化蛋白大小符合VP1-U大小(15.5 kD)。純化后蛋白終濃度BCA定量為3.3 mg/ml。氨基酸末端測(cè)序證實(shí)蛋白序列正確。

M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)(kD)；1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo)后；3：超聲破碎上清；4：上清洗脫液；5：包涵體溶解液洗脫峰；6：包涵體溶解液洗脫峰超濾。

3 討論

HBoV VP1-U原始序列并不適合原核表達(dá)，而密碼子優(yōu)化后，獲得了理想的表達(dá)效果。為使蛋白的純化相對(duì)簡(jiǎn)便和高效，首選pET30a(+)母載體自帶組氨酸標(biāo)簽表達(dá)，鎳離子親和層析。HBoV VP1-U活性氨基酸集中在較靠近N端的位置，而其C端所連接的VP2的N端富含甘氨酸且多變，因此采用C端融合表達(dá)可能最大限度保證蛋白的抗原性。在pET30a(+)載體中選用NdeI(CA^TATG)和XhoI(C^TCGAG)為限制酶，可以使VP1-U 5’端處于SD序列的理想位置，且3’端融合表達(dá)除純化標(biāo)簽6His外盡可能少。

菌體代謝優(yōu)先消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖，當(dāng)葡萄糖不足時(shí)開始利用乳糖為能源。pET30a(+)/VP1-U超表達(dá)時(shí)，因葡萄糖已經(jīng)消耗為不足而質(zhì)粒通過T7啟動(dòng)子啟動(dòng)乳糖操縱子，乳糖操縱子控制目的基因VP1-U超表達(dá)，因此，在培養(yǎng)初期添加適量葡萄糖使得質(zhì)粒不啟動(dòng)目的基因表達(dá)而有利增菌，IPTG誘導(dǎo)時(shí)細(xì)菌數(shù)量足夠大即可在短期里獲得大量超表達(dá)目的蛋白。

許多真核蛋白基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物以一種無活性的、不溶于水的包涵體形式存在。包涵體除含有重組蛋白聚合物外，還含有核酸和其他雜蛋白。超聲裂解菌體和回收包涵體可以去除大部分雜質(zhì)，但還需要復(fù)性和純化才能得到高純度的活性蛋白。HBoV VP1-U表達(dá)，雖然菌體裂解上清也存在目的蛋白帶，但從上清不能純化來看，似乎是超聲裂解時(shí)目的蛋白和其他雜蛋白斷裂所致，因此，VP1-U主要以包涵體的形式存在。我們采用，在鎳離子柱上更換緩沖體系，洗脫的同時(shí)得到復(fù)性蛋白，大大簡(jiǎn)化了流程。

螯和親和層析的關(guān)鍵是上柱樣品的置備和緩沖體系的設(shè)計(jì)。純化過程中我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)的產(chǎn)物非常容易被蛋白酶降解，包涵體溶解前需要低溫操作，并加入蛋白酶抑制劑。保持上柱樣品的溶劑體系與洗柱、洗脫體系一致，并且能保持一致，是流程設(shè)計(jì)中要考慮的關(guān)鍵問題。目的蛋白的功能研究涉及到磷脂酶活性，避免采用磷酸鹽緩沖體系。本研究采用自設(shè)計(jì)的高倍濃度的Tris緩沖體系儲(chǔ)存液，工作液隨用隨攙兌，最大限度保持了緩沖體系的一致，成功得到了活性[6]高濃度蛋白洗脫液。這種梯度攙兌法也是實(shí)現(xiàn)邊洗脫邊復(fù)性的基礎(chǔ)。

本研究通過包涵體的提取、變性、目的蛋白的純化和復(fù)性等一系列工作，得到了有生物學(xué)活性的純?nèi)诤系鞍?，為HBoV的免疫學(xué)檢測(cè)方法研究和蛋白功能研究提供了技術(shù)路線和材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Allander T,Tammi MT,Eriksson M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:12891.

[2]Simon A,Groneck P,Kupfer B,et al.Detection of bocavirus DNA in nasopharyngeal aspirates of a child with bronchiolitis[J].J Infect,2007,54(3):e125.

[3]Hirose Y,Hamada H,Wakui T,et al.Characteristic systemic cytokine responses in children with human bocavirus-positive lower respiratory tract infection[J].Microbiol Immunol,2014,58(3):215.

[4]Cotmore S F,Tattersall P.Characterization and molecular cloning of a human parvovirus genome[J].Science.1984,226:1161.

[5]Mavis AM,Michael GR.The Structure of Human Parvovirus B19[A].Anderson LJ,Young NS (eds).Human Parvovirus B19[M].Monogr Virol.1997,vol 20:3-15.

[6]Qu XW,Liu WP,Qi ZY,et al.Phospholipase A2-like activity of human bocavirus VP1 unique region[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,365(1):158.