黃柳倩，張 晨，張 靜，崔 芳，邱化玉，何杏杏，尹守春

(杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 310036)

前 言

隨著社會(huì)進(jìn)步和人類發(fā)展，人們對健康問題以及生命領(lǐng)域越來越重視.近幾年，含巰基的生物分子由于它們在維持生物系統(tǒng)方面扮演了重要的角色而引起科學(xué)家們廣泛關(guān)注[1].現(xiàn)已證實(shí)，細(xì)胞中巰基含量的變化會(huì)引發(fā)許多常見的疾病，例如，癌癥、老年癡呆癥和心血管疾病等[2].尤其是半胱氨酸的缺乏與很多生理?xiàng)l件相關(guān)聯(lián)，比如，孩子生長緩慢、頭發(fā)褪色、水腫、嗜睡、肝損傷和皮膚損傷等[3].因此，在生物醫(yī)療領(lǐng)域定量檢測這些含有巰基的生物分子具有非常重大的意義.

圖1 化合物RS1的結(jié)構(gòu)式

4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮雜-s-引達(dá)省(BODIPY)具有高的熒光量子產(chǎn)率、在可見光區(qū)有強(qiáng)的吸收和發(fā)射、較好的光學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)良的光化學(xué)物理性能，使得BODIPY可以用于設(shè)計(jì)合成各種響應(yīng)性的化學(xué)傳感器，例如氧化還原型[4]、pH值響應(yīng)型[5]、化學(xué)反應(yīng)型[6]等.同時(shí)BODIPY熒光染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)易于修飾，這可以使其吸收和發(fā)射譜帶紅移至紅外或近紅外區(qū)[7].在這個(gè)波長范圍的熒光探針由于減弱了生物體自身的熒光發(fā)射和對活細(xì)胞的光損傷，因此非常適應(yīng)于對生物細(xì)胞的檢測[8].

課題組曾合成了一種基于BODIPY的熒光傳感器RS1(如圖1)[9].RS1在乙腈溶液中可以選擇性地與Hg2+絡(luò)合，絡(luò)合后其熒光增強(qiáng)且發(fā)生藍(lán)移.由于含巰基的生物分子可以與Hg2+具有良好的絡(luò)合能力，因此本文將研究RS1-Hg2+絡(luò)合物對含巰基氨基酸的檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

金屬鹽Hg(ClO4)2從Aldrich公司購買；光譜級乙腈從Across公司購買.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

目標(biāo)化合物RS1用1H NMR、13C NMR和ESI-MS等進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)表征，具體表征數(shù)據(jù)見參考文獻(xiàn)[9].采用Perkin Elmer Lambda 40 UV-可見分光光度計(jì)測試紫外可見吸收光譜.采用HITACHI F-2700熒光分光光度計(jì)測試穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

分別配置濃度為2 μmol/L的RS1乙腈溶液、濃度為3 mmol/L的金屬汞離子水溶液和半胱氨酸水溶液.然后將20 μL的金屬汞離子水溶液滴加到3 mL RS1乙腈溶液中，最后逐滴加入半胱氨酸水溶液，并用紫外和熒光光譜跟蹤滴定過程.

2 結(jié)果與討論

2.1 半胱氨酸滴定的紫外-可見吸收光譜

如圖2所示，RS1乙腈溶液在550 nm處顯示出一個(gè)對應(yīng)于BODIPY生色基團(tuán)S0→S1躍遷的最大紫外吸收峰.20 μmol/L Hg2+離子加入后，在550 nm處吸收峰顯著降低，同時(shí)在577 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的強(qiáng)吸收峰.當(dāng)加入不同濃度的半胱氨酸(Cys)后，577 nm處的最大吸收峰逐漸降低，而在550 nm處吸收峰逐步增加.當(dāng)Cys濃度達(dá)到40 μmol/L時(shí)，此時(shí)的紫外吸收與自由的RS1紫外吸收基本一致.這說明由于Hg2+與含巰基的半胱氨酸(Cys)絡(luò)合能力比與RS1絡(luò)合能力強(qiáng)，RS1-Hg2+絡(luò)合物中的Hg2+被Cys奪取而釋放RS1.這一過程可以通過肉眼直接觀察，20 μmol/L Hg2+離子的加入會(huì)導(dǎo)致RS1乙腈溶液的顏色由原來的粉紅色變?yōu)樽仙?，而?dāng)逐漸加入不同濃度的半胱氨酸(Cys)后，溶液顏色又從紫色逐步變成粉紅色.

圖2 不同濃度(1, 2, 4, 6, 8, 10,12, 15, 30, 40, 50 μmol/L)Cys存在下，RS1-Hg2+(2 μmol/L) 在CH3CN中的紫外可見吸收光譜

圖3 在RS1-Hg2+的CH3CN溶液中(2 μmol/L)加入不同濃度(1, 2, 4, 6, 8, 10,12, 15, 30, 40,50 μmol/L)的Cys熒光發(fā)射光譜 (λex = 520 nm)

2.2 半胱氨酸滴定的熒光發(fā)射光譜

圖3所示的是RS1-Hg2+在不同半胱氨酸(Cys)濃度存在條件下的熒光滴定譜圖.當(dāng)使用激發(fā)波長為520 nm激發(fā)時(shí)，加入20 μmol/L Hg2+金屬離子后，594 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯增強(qiáng).然而，隨著Cys逐步滴加到RS1-Hg2+絡(luò)合物中，594 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐步降低；當(dāng)Cys濃度增加到40 μmol/L，RS1-Hg2+的熒光強(qiáng)度降低到自由的RS1熒光發(fā)射強(qiáng)度；進(jìn)一步增加Cys的濃度，熒光強(qiáng)度基本沒有變化.未絡(luò)合的RS1熒光發(fā)射很弱，這主要是由于二(2-甲基吡啶)胺基團(tuán)的氮原子和BODIPY核發(fā)生了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)過程導(dǎo)致了熒光淬滅.當(dāng)RS1和Hg2+絡(luò)合后，胺的供電子性減弱，抑制了ICT過程，從而提高了熒光發(fā)射強(qiáng)度.當(dāng)向RS1-Hg2+體系中加入半胱氨酸(Cys)時(shí)，Hg2+與半胱氨酸(Cys)絡(luò)合釋放出RS1，使得熒光強(qiáng)度逐漸降低.

2.3 半胱氨酸的熒光檢測極限

向RS1-Hg2+乙腈溶液中不斷地滴加半胱氨酸時(shí)，隨著半胱氨酸濃度的變化，該體系在熒光發(fā)射譜圖上的熒光強(qiáng)度與半胱氨酸濃度呈現(xiàn)線性變化(如圖4所示).因此，利用此線性關(guān)系計(jì)算得到k=-24.47，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得到濃度標(biāo)準(zhǔn)偏差σ=5.06 μmol/L，再根據(jù)公式3σ/|k|我們計(jì)算出半胱氨酸的熒光檢測極限為0.62 μmol/L(其中σ是標(biāo)準(zhǔn)偏差，k是樣品熒光強(qiáng)度對濃度的斜率).這一值低于食品及藥物管理局規(guī)定在化妝品方面的檢測極限(1 μmol/L).因此，RS1-Hg2+絡(luò)合物可以用于半胱氨酸的檢測.

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

為了考察其他氨基酸對于半胱氨酸的檢測是否有影響，我們做了其他氨基酸對于半胱氨酸檢測的干擾實(shí)驗(yàn)，即將100 μmol/L的各種氨基酸分別加入到含20 μmol/L半胱氨酸的RS1-Hg2+乙腈溶液中，檢測這些氨基酸的加入是否會(huì)導(dǎo)致含20 μmol/L半胱氨酸的RS1-Hg2+熒光發(fā)射峰強(qiáng)度發(fā)生變化.如圖5所示，可以看到除了谷胱甘肽(GSH)和蘇氨酸(Thr)會(huì)導(dǎo)致RS1-Hg2+-Cys的熒光發(fā)射強(qiáng)度有20%的增強(qiáng)外，其他氨基酸對于半胱氨酸的檢測幾乎沒有干擾或者很小的干擾.因此，進(jìn)一步說明RS1-Hg2+絡(luò)合物可用于對半胱氨酸的檢測.

圖4 在RS1-Hg2+的CH3CN溶液中(2 μmol/L)加入不同濃度(1, 2, 4, 6, 8, 10,12, 15μmol/L)Cys的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化(λex = 520 nm)

圖5 含20 μmol/L Cys的RS1-Hg2+ (2 μmol/L)乙腈溶液與加入100 μmol/L各種氨基酸的熒光強(qiáng)度對比圖

3 結(jié) 論

本文利用Hg2+與含巰基的半胱氨酸絡(luò)合能力比與RS1絡(luò)合能力強(qiáng)的特點(diǎn)，成功實(shí)現(xiàn)了用RS1-Hg2+絡(luò)合物對半胱氨酸進(jìn)行檢測.RS1-Hg2+絡(luò)合物對半胱氨酸的熒光檢測極限為0.62 μmol/L，低于食品及藥物管理局規(guī)定的在化妝品方面的檢測極限.因此，RS1-Hg2+絡(luò)合物有望用于在化妝品領(lǐng)域中對半胱氨酸的檢測.

參考文獻(xiàn):

[1]Kim S K, Lee D H, Hong J,etal. Chemosensors for pyrophosphate[J]. Accounts of Chemical Research,2009,42(1):23-31.

[2]Seshadri S, Beiser A, Selhub J,etal. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and Alzheimer’s disease[J]. New England Journal of Medicine,2002,346(7):476-483.

[3]Shahrokhian S. Lead phthalocyanine as a selective carrier for preparation of a cysteine-selective electrode[J]. Analytical Chemistry,2001,73(24):5972-5978.

[4]Carmony L H, Erica M W L, Sumit S M,etal. Investigating the Antimalarial Action of 1,2,4-Trioxolanes with Fluorescent Chemical Probes[J]. J Med Chem,2011,54(23):8207-8213.

[5]Alexander N, Andrei Y K, Nienhaus G U,etal. Anthracene-BODIPY Dyads as Fluorescent Sensors for Biocatalytic Diels-Alder Reactions[J]. J Am Chem Soc，2010, 132(8): 2646-2654.

[7]Loudet A, Burgess K. BODIPY dyes and their derivatives: Syntheses and spectroscopic properties[J]. Chem Rev,2007,107(11):4891-4932.

[8]Smith B A, Akers W J, Leevy W M,etal. Optical imaging of mammary and prostate tumors in living animals using a synthetic near infrared Zinc(II)-dipicolylamine probe for anionic cell surfaces[J]. J Am Chem Soc,2010,132(1):67-69.

[9]Huang J L, Ma X W, Liu B,etal. A colorimetric and ratiometric turn-on BODIPY-based fluorescent probe for double-channel detection of Cu2+and Hg2+[J]. Journal of Luminescence,2013,141:130-136.