孫 揚，陸文怡，張 艷，王廣洋，孫佳麗，薛大偉，張曉勤

(杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上最主要和古老的栽培作物之一，具有生育期短、早熟、抗逆性強以及適應性廣等優(yōu)點，是全球種植面積僅次于玉米、小麥和水稻的谷類作物[1]，也是遺傳學模式植物之一.植物類病斑突變體(lesion mimic mutant，LMM)是指植物在沒有明顯損傷、逆境脅迫或者外界病原物侵染的條件下，能夠在葉片、葉鞘或者整株上自發(fā)形成壞死斑的一類突變體[2].研究發(fā)現有些類病斑突變體的發(fā)生與正常生理功能或細胞發(fā)育有關，有些卻與植物抗病抗逆的防衛(wèi)反應緊密相關[3].這些類病斑壞死突變體的表型與植物在防衛(wèi)過程中的過敏反應很相似，不少LMM在類病斑壞死形成之前或之后還表現出對病原物局部或系統抗性的增強，并且表現出與細胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 有關[4]，由此推測類病斑壞死突變體和過敏反應可能具有一些共同的形成機制.

大麥突變體研究為大麥分子遺傳學研究、基因功能分析和種質資源創(chuàng)新提供有價值的材料[5].與水稻相比，大麥類病斑突變體目前研究較少.類病斑突變體中的局部組織壞死是一種在沒有病原菌侵染條件下自發(fā)形成的程序性細胞死亡，這種遺傳上的缺陷往往會導致植株對病蟲的抗性增強和防衛(wèi)基因的組成型表達，研究植物類病斑突變體壞死斑的形成機制對理解植物細胞程序性死亡的信號傳導途徑和抗病機理具有重要意義，同時對選育抗病性狀的材料來改良農作物品種有積極的推動作用.在前期工作中，本課題組從大麥浙農大3號(ZJU3)的EMS突變體庫中鑒定到一個典型的類病斑壞死突變體[5]，命名為bspl1(barley spotted leaf 1)，該突變體從苗期開始葉片上會自發(fā)出現紅棕色的類病斑，至分蘗期后類病斑不再變大且不導致葉片枯死，不影響植株抽穗、結實.本研究對bspl1進行了生理和遺傳的初步分析，以期為今后該突變體基因的克隆及病斑形成的分子機制研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

EMS誘變產生的類病斑突變體bspl1以及野生型大麥ZJU3.

1.2 抗氧化酶測定方法

分別取種植3、5、7周的bspl1和對照組ZJU3各3株，選取同一時期的葉片，混合后稱取0.5 g鮮樣加8 mL 0.05 mol/L PBS(pH7.8)于冰浴中研磨，4 ℃下1 000 r/min離心20 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性測定，所有測定重復3次.

SOD活性測定采用氯化硝基四氮唑藍(NBT)光還原法；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法；CAT活性測定采用紫外吸收法.

1.3 類病斑性狀的遺傳分析

2 結 果

2.1 大麥類病斑突變體遺傳分析

表1 突變體bspl1與野生型ZJU3有性雜交試驗結果

表2 突變體bspl1與Morex有性雜交試驗結果

2.2 類病斑突變體生理分析

2.2.1 超氧化物歧化酶活性

SOD是細胞內自由基清除系統中一個關鍵性酶，在保護細胞器免遭活性氧(ROS)損害中起至關重要的作用，是衡量植物衰老的良好指標.測定超氧化物歧化酶活性的結果如圖1a所示，突變體bspl1的SOD活性在播種后5～7周較ZJU3明顯增高，由11.8 U/g(鮮質量，以下同)升至18.5 U/g.而ZJU3的SOD活性則始終維持在10 U/g左右.

2.2.2 過氧化物酶活性

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系.在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，一般在老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱.實驗發(fā)現早衰減產的水稻根系中過氧化物酶的活性增加[6]，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標.由圖1b可知，bspl1的POD活性隨著時間的推移逐步增大，在7周后達到22.2 U/g，而ZJU3的POD活性幾乎保持不變.這表明由于突變體中活性氧含量提高，過氧化物酶被激活而活性提高，加快了活性氧清除機制.

圖1 bspl1與ZJU3的SOD、POD及CAT活性

2.2.3 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶是植物重要的保護酶之一，主要存在于乙醇酸循環(huán)體、過氧化物酶體及其它細胞器中，專一作用于H2O2，是植物體內清除H2O2的主要酶類.過氧化氫酶活性測定結果(圖1c)表明，與野生型相比，突變體在3周以后過氧化氫酶的活性有了較大的提高，從3.6 U/g提高至6.2 U/g，表明由于突變體中活性氧含量提高，過氧化氫酶被激活而活性提高，加快了活性氧清除機制.

3 討 論

大麥類病斑突變體bspl1是經EMS誘變處理而產生的葉片散布紅棕色的類病斑突變體.其性狀經多代自交繁殖，已能穩(wěn)定遺傳.從bspl1與ZJU3以及bspl1與Morex的正反交結果看出F1代均表現為正常植株，F2代則出現類病變植株，且類病變突變體植株數與正常植株數的比例為1∶3.F2代的性狀分離比說明穩(wěn)定后的突變體植株的類病斑遺傳是符合孟德爾分離定律的，故可確定該類病變突變受一對隱性核基因控制.

很多復雜的原因可導致植物形成類病斑，既可能是基因突變引起的，也可能與外界環(huán)境如光照、溫度、濕度和養(yǎng)分等相關.隨著越來越多LMM基因被發(fā)現、克隆與功能分析，植物類病斑突變體壞死斑表型形成機制的研究也越來越深入，目前已知的類病斑形成機制有以下幾種：1)抗病基因的改變或過量表達.抗病基因的突變或者信號傳導途徑的改變引起細胞過敏反應，從而導致大量的細胞程序性死亡，產生類病斑.例如番茄過量表達Pto基因[7]、玉米RPL位點[8]的突變導致類病斑的產生.2)植物的正常代謝途徑發(fā)生紊亂.研究發(fā)現葉琳代謝途徑中一系列催化酶基因發(fā)生突變可能引起植物產生類病斑[9].3)PCD失控導致植物類病斑壞死的發(fā)生.擬南芥Isd1突變體中，LSD1編碼的一個鋅指蛋白，對植物防衛(wèi)反應和PCD起負調控作用；Kim等[10]發(fā)現水稻中的OsACD R1基因能編碼Raf-like有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKK)，該激酶過量表達可誘導水稻葉片出現類病斑.4)環(huán)境因素(如光照、溫度與濕度等)的改變導致部分植株類病斑的形成.王建軍等[11]對6個類病斑表型的突變體材料進行遮光實驗，發(fā)現光源、溫度均影響類病斑的形成.5)水楊酸、茉莉酸和乙烯等激素以及其他信號轉導因子也和植物類病斑壞死的形成有關系.研究發(fā)現擬南芥類病斑突變體Isd6和Isd7中的水楊酸在類病斑的形成中起了關鍵作用[12].6)與ROS、自由基有關.許多類病斑突變體都顯示在病斑周圍有ROS的積累.玉米類病斑突變體les22類病斑的形成是由于ROS造成的[13].

Dangl等[14]在1996年已證實了類病斑不是由病原菌導致的，而是植物程序性細胞死亡的產物.因此，類病斑突變體開始受到了廣泛的關注，并成為研究植物抗病性機制及程序性細胞死亡途徑的重要實驗材料.在類病斑出現時，許多突變體都伴有與病原菌侵染相關物質的組成性表達，包括酚類物質的積累、胼胝體的沉積、植保素水平的上升以及活性氧中間代謝物(reactiveoxygenin termediate，ROI)的產生等，這些物質具有抵抗或抑制病原菌的作用，尤其是ROI能直接殺死病原菌并啟動過敏反應[15].在水稻類病變中也普遍存在著在類病斑的周圍出現H2O2或O2-的過量積累[16-17].ROI的積累可能是其生物合成途徑中的某些關鍵酶(如NADPH氧化酶)的活性失調所引起.本實驗結果顯示，突變體植株bspl1的 SOD、POD、CAT 活性都明顯高于野生型植株，可見突變體植株中活性氧的積累明顯.這些結果表明，bspl1的類病斑的發(fā)生與細胞程序性死亡有關.

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