錢 洪, 沈雙雙, 呂 楊, 楊金鳳

(解放軍海軍安慶醫(yī)院, 1. 腫瘤內(nèi)科; 2. 病理科, 安徽 安慶, 246003)

肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率的逐年升高，引起了世界越來越多研究者的關(guān)注。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型，約占肺癌總數(shù)的70%～80%。約70%的NSCLC患者在確診時已無法手術(shù)摘除，或完全切除術(shù)后輔助化療出現(xiàn)耐藥性，是NSCLC整體治療效果不佳的重要原因[1-2]。近年來研究[3]表明，體內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致NSCLC發(fā)生發(fā)展?jié)撛跈C(jī)制。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是炎癥反應(yīng)重要參與因子，在NSCLC的發(fā)展過程中發(fā)揮諸多作用[4]，而國內(nèi)外COX-2與磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(P-ACC)相關(guān)性的研究鮮見報道。本研究通過免疫組化法，比較P-ACC和COX-2蛋白在NSCLC患者肺組織及正常肺組織中的表達(dá)情況，并探討二者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年10月—2014年3月收治住院的病理檢查確診為NSCLC且具有完整臨床病理資料的52例患者肺組織標(biāo)本作為NSCLC組，16例因炎性假瘤或其他結(jié)核瘤行肺葉切除患者的肺組織標(biāo)本作為對照組，所有腫瘤患者術(shù)前均未行放化療治療。NSCLC組，男38例，女14例；年齡22～72歲，平均(58.56±10.21)歲；其中鱗癌26例，腺癌12例，腺鱗癌9例，大細(xì)胞癌5例; TNM分期: Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期32例。2組患者的性別、年齡、病程等一般資料無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。本實驗經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

所有標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋切片，厚度約4 μm。采用免疫組織化學(xué)二步法檢測蛋白著色程度。根據(jù)所應(yīng)用的P-ACC一抗(購自美國Cell Signaling Technology公司)及COX-2一抗(購自美國Santa Cruz公司)的說明書要求預(yù)處理組織切片; 3%過氧化氫去離子水孵育5 min，PBS沖洗3 min 3次；滴加一抗, 37 ℃孵育1 h, PBS沖洗3 min 3次；滴加二抗, 37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3 min 3次；應(yīng)用DAB溶液顯色，水洗、蘇木素復(fù)染2 min、鹽酸酒精分化、100%乙醇脫水、氨水返藍(lán)5 min; 二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。

1.3 結(jié)果判定

結(jié)果由2名不知情病理醫(yī)師進(jìn)行評判。在400倍視野下每例標(biāo)本隨機(jī)選取不重復(fù)5個視野。陽性率即視野中陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比：陽性率0～10%，即為表達(dá)陰性(-); 10%～25%，為表達(dá)弱陽性(+); 25%～50%, 為表達(dá)中度陽性(2+); 陽性率>50%，為表達(dá)強(qiáng)陽性(3+)。

2 結(jié) 果

2.1 2組肺組織中P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)情況

對照組肺組織P-ACC蛋白染色主要為陽性(13/16，81.25%), 而NSCLC組僅15例呈陽性染色(15/52，28.85%), 2組比較有顯著差異(P<0.01); COX-2在對照組肺組織中陽性表達(dá)較低(3/16, 18.75%), 而在NSCLC組織中陽性率較高(33/52，63.46%), 2組比較有顯著差異 (P<0.01)。

表1 P-ACC與COX-2蛋白表達(dá)情況 n

2.2 P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

NSCLC組織中P-ACC蛋白的陽性率與患者性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理類型均無相關(guān)性，而與腫瘤大小和TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)。

COX-2的陽性率與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及病理類型不相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期則密切相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.3 P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

52例NSCLC組織中, P-ACC表達(dá)陰性的NSCLC組織COX-2陽性表達(dá)率為86.67%, P-ACC表達(dá)陽性的NSCLC組織COX-2陽性表達(dá)率為59.09%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。P-ACC表達(dá)與COX-2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表2 P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 NSCLC組織中P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

NSCLC早期診斷困難[5], 發(fā)現(xiàn)腫瘤時已有超過40%的患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且治療生存率低，5年生存率僅為15%左右[6]。腫瘤的組織學(xué)類型檢查和傳統(tǒng)臨床表現(xiàn)分期對于判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療的效力有限。近年來，隨著基因、表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，從分子生物學(xué)角度深入研究NSCLC等，有利于從本質(zhì)上認(rèn)識腫瘤的發(fā)病機(jī)制，實現(xiàn)早期診斷和個體化治療[7]。

P-ACC是乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化形式，炎癥反應(yīng)中AMP活化蛋白激酶(AMPK)被激活，磷酸化其下游直接靶蛋白ACC使其失活，因此P-ACC可作為AMPK被激活的直接指標(biāo)[8]。AMPK的活性與炎癥分子的表達(dá)水平存在密切關(guān)系，其激活后可顯著減輕機(jī)體炎癥介質(zhì)的表達(dá)，減少組織的炎癥損傷[9]。COX-2作為炎癥反應(yīng)重要節(jié)點，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，誘導(dǎo)腫瘤部位血管生成，抑制細(xì)胞凋亡與免疫功能，促進(jìn)腫瘤浸潤與侵襲等[10-11]。有學(xué)者[12]研究證實了在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中, COX-2蛋白染色程度強(qiáng)于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織。有報告研究COX-2在Ⅰ期NSCLC患者的表達(dá)情況，結(jié)果顯示早期NSCLC中COX-2過表達(dá)則患者預(yù)后較差，提示過表達(dá)的COX-2可作為判斷NSCLC患者預(yù)后獨(dú)立不良因素[13]。本研究表明COX-2蛋白在正常肺組織中低表達(dá)，而在NSCLC組織中高表達(dá)，并且在晚期NSCLC中表達(dá)強(qiáng)烈，與上述研究結(jié)果一致，進(jìn)一步表明COX-2在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究重點研究了P-ACC與COX-2的關(guān)系，結(jié)果顯示P-ACC及COX-2幾乎與臨床病理參數(shù)無關(guān)，可能與病例選擇有關(guān)，因為病例選擇上沒有特意選擇發(fā)病率最高的腺癌[14]。但本研究證實P-ACC陰性組的COX-2蛋白表達(dá)陽性率與P-ACC陽性組差異顯著, P-ACC表達(dá)與COX-2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。說明在NSCLC組織中, P-ACC蛋白表達(dá)下調(diào)可能激活COX-2的陽性表達(dá)，促進(jìn)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，聯(lián)合檢測NSCLC組織的P-ACC與COX-2蛋白表達(dá)水平，對臨床評估NSCLC病理分期、惡性程度及預(yù)后有顯著意義，為NSCLC的臨床治療提供了新的思路。

[1] Chen L K, Liang Y, Yang Q Y, et al. Triplet platinum-based combination sequential chemotherapy improves survival outcome and quality of life of advanced non-small cell lung cancer patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(5): 1863.

[2] Margaritora S, Cesario A, Cusumano G, et al. Pneumonectomy with and without induction chemo-radiotherapy for non-small cell lung cancer: short and long-term results from a single centre[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013, 17(1): 29.

[3] Dong L X, Sun L L, Zhang X, et al. Negative regulation of mTOR activity by LKB1-AMPK signaling in non-small cell lung cancer cells[J]. Acta Pharmacol Sin, 2013, 34(2): 314.

[4] Meares G P, Qin H, Liu Y, et al. AMP-activated protein kinase restricts IFN-γ signaling[J]. J Immunol, 2013, 190(1): 372.

[5] Yao Y, Fan Y, Wu J, et al. Potential application of non-small cell lung cancer-associated autoantibodies to early cancer diagnosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 423(3): 613.

[6] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2008, 58(2): 71.

[7] 周南, 翁珊珊. 非小細(xì)胞肺癌分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 癌癥進(jìn)展, 2011, 9(1): 33.

[8] Liu L, Cash T P, Jones R G, et al. Hypoxia-induced energy stress regulates mRNA translation and cell growth[J]. Mol Cell, 2006, 21(4): 521.

[9] Jeon S M, Chandel N S, Hay N. AMPK regulates NADPH homeostasis to promote tumour cell survival during energy stress[J]. Nature, 2012, 485(7400): 661.

[10] Lin C C, Hsieh H L, Shih R H, et al. Up-regulation of COX-2/PGE2by endothelin-1 via MAPK-dependent NF-kappaB pathway in mouse brain microvascular endothelial cells[J]. Cell Commun Signal, 2013, 11(1): 8.

[11] Huang W C, Chai C Y, Chen W C, et al. Histamine regulates cyclooxygenase 2 gene activation through Orai1-mediated NFκB activation in lung cancer cells[J]. Cell Calcium, 2011, 50(1): 27.

[12] Hida T, Yatabe Y, Achiwa H, et al. Increased expression of cyclooxygenase 2 occurs frequently in human lung cancers, specifically in adenocarcinomas[J]. Cancer Res, 1998, 58(17): 3761.

[13] Kim H S, Kim M J, Kim E J, et al. Berberine-induced AMPK activation inhibits the metastatic potential of melanoma cells via reduction of ERK activity and COX-2 protein expression[J]. Biochem Pharmacol, 2012, 83(3): 385.

[14] 李韶今, 張相民, 李榮, 等. 非小細(xì)胞肺癌組織中P-ACC及COX-2的相關(guān)性研究[J]. 中國腫瘤臨床, 2014, 41(1): 68.