嚴(yán)鎮(zhèn)鈞，張小兵

(1.湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 黃石 435002;2.湖北省黃石市第十八中學(xué)，湖北 黃石 435001)

聚乙二醇介導(dǎo)細(xì)胞融合的優(yōu)化條件探究

嚴(yán)鎮(zhèn)鈞1，張小兵2

(1.湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 黃石 435002;2.湖北省黃石市第十八中學(xué)，湖北 黃石 435001)

細(xì)胞融合技術(shù)是細(xì)胞工程中的一項(xiàng)核心基礎(chǔ)技術(shù)，聚乙二醇(PEG)是最常用的促融劑，廣泛地被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域。探討更符合細(xì)胞工程要求的、融合后的細(xì)胞更大限度地保持生理活性的、快速、有效的細(xì)胞融合條件。以牛紅細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，PEG作促融劑介導(dǎo)牛紅細(xì)胞融合，研究不同的融合溫度、PEG作用時(shí)間、PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對(duì)細(xì)胞融合率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選擇融合溫度為39℃，時(shí)間為15min，選用相對(duì)分子質(zhì)量為2000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%的PEG，可以在細(xì)胞受毒害較小的同時(shí)得到最佳的融合效果，融合率能達(dá)到21.26%.

細(xì)胞工程；聚乙二醇；使用條件優(yōu)化研究

細(xì)胞工程是四大生物工程之一，其核心基礎(chǔ)技術(shù)之一是細(xì)胞融合技術(shù)。細(xì)胞與組織不同，不排斥異類、異種細(xì)胞，因此細(xì)胞融合不受種屬的局限，可實(shí)現(xiàn)種間生物體細(xì)胞的融合，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能，因而是改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限和生殖壁壘，極大地?cái)U(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍；細(xì)胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，在技術(shù)和儀器設(shè)備上的要求不象基因工程那樣復(fù)雜，投資少，有利于廣泛開(kāi)展研究和推廣，有著重大的實(shí)踐意義。

人工細(xì)胞融合開(kāi)始于20世紀(jì)50年代，60年代到70年代作為一門(mén)新興的技術(shù)發(fā)展很快，有力地推動(dòng)了生物科學(xué)各領(lǐng)域的發(fā)展，目前，細(xì)胞融合技術(shù)已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段，其應(yīng)用范圍極廣，已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開(kāi)創(chuàng)性的研究成果，而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，其發(fā)展前景及產(chǎn)生的影響日益顯著。

目前有許多促使細(xì)胞融合的技術(shù)，但有些技術(shù)還處于剛剛起步階段，尚不成熟，或者存在某種生產(chǎn)應(yīng)用方面的缺陷，例如利用滅活的仙臺(tái)病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合盡管可以得到較高的融合率，對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞都適宜，并且仙臺(tái)病毒能在牛胚中大量繁殖，但其缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、不穩(wěn)定，在保存過(guò)程中促融合活性會(huì)降低，并且制備過(guò)程比較煩瑣，而且病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾，正是由于這些缺點(diǎn)，目前滅活的仙臺(tái)病毒已逐漸被聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)取代；利用激光融合技術(shù)雖然易于實(shí)現(xiàn)特異性細(xì)胞融合,參數(shù)易于控制，操作方便，而且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，但它只能逐一處理細(xì)胞,不能像PEG一樣同時(shí)處理大量細(xì)胞[1]。

自從20 世紀(jì)70 年代Kao和Michayluk用PEG成功介導(dǎo)大麥、大豆等植物原生質(zhì)體融合后[2],PEG法介導(dǎo)細(xì)胞融合以其容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特別的儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)， 被普遍地

應(yīng)用于生物、遺傳、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域，并且是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞融合的促融劑。2009年，Huynh NT等利用聚乙二醇介導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展了納米醫(yī)學(xué)中的一個(gè)新領(lǐng)域-脂質(zhì)毫超微囊劑技術(shù)[3]。Ogawa F等用PEG介導(dǎo)經(jīng)紫外線照射形成的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)入了IL-2基因或LacZ基因的樹(shù)狀細(xì)胞融合，融合細(xì)胞表達(dá)出了組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)classI、MHCclassII、CD86、CD11c和CD8alpha[4]。Dan K等用PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的技術(shù)證明了能高效抑制單純皰疹病毒(HSV)復(fù)制的多金屬氧酸鹽PM-19并非是在病毒感染的融合階段起作用[5]。

另外，單克隆抗體技術(shù)就是通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的，對(duì)生命科學(xué)的研究及醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用產(chǎn)生了重大影響，其中，PEG作為促融劑發(fā)揮了不可替代的作用，比如，Bhanuprakash V等用激活的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)PEG介導(dǎo)融合制造了藍(lán)舌病病毒的單克隆抗體[6]。Changhee Yoo等用PEG(Mr=1500)介導(dǎo)經(jīng)熱處理后的前列腺癌細(xì)胞(DU145 cells)和成熟的抗原呈遞細(xì)胞樹(shù)狀細(xì)胞(Dendritic cells ，DCs)進(jìn)行雜交，制備前列腺癌細(xì)胞系疫苗[7]。Guo GH等用50% PEG介導(dǎo)食管癌細(xì)胞系(esophageal carcinoma cell line 109，EC109)和樹(shù)狀細(xì)胞(Dendritic cells ，DCs)融合產(chǎn)生抗腫瘤的雜交疫苗[8]。Homma S等用自體樹(shù)狀細(xì)胞和自體胃癌細(xì)胞通過(guò)PEG介導(dǎo)融合，使細(xì)胞產(chǎn)生抗體，再將融合后的細(xì)胞每?jī)芍芤淮蔚刈⑸涞絿?yán)重胃癌的患者皮下，取得了有效的臨床治療效果[9]?？傊肞EG作促融劑的細(xì)胞融合技術(shù)，已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，而在這些應(yīng)用中，學(xué)者們采用的實(shí)驗(yàn)條件是不一樣的[10～14]。

目前，人們有時(shí)采用PEG介導(dǎo)融合技術(shù)和一些物理手段如激光融合技術(shù)相結(jié)合的方法，以進(jìn)一步提高融合率。但是，影響PEG作用效果的因素較多，加大了獲得理想細(xì)胞融合率的難度[15]。本文從融合溫度、時(shí)間、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)分子質(zhì)量等幾個(gè)方面，對(duì)PEG應(yīng)用于細(xì)胞工程中的最適條件做了探討。

1 材料和方法

1.1材料

Alsver 液(pH7.4)、0.85%生理鹽水、GKN 液、PEG(Mr=600)、PEG(Mr=1000)、PEG(Mr=2000)、PEG(Mr=4000)、PEG(Mr=6000)、健康牛靜脈血。

1.2方法

1.2.1 牛紅細(xì)胞的獲得 取健康牛靜脈血10mL至盛有40mL Alsver溶液的瓶中，混勻后置于4℃冰箱，可保存一周。實(shí)驗(yàn)時(shí)取牛血1mL，移入10mL離心管， 加入4mL 0.85%生理鹽水混勻，1200r/min離心5 min；棄上清液，加0.85%生理鹽水5mL，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散，混勻后1000r/min離心5min，重復(fù)上述條件，再離心洗滌1次。收集最后1次離心沉淀的紅細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞融合溫度的選擇 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，將紅細(xì)胞以預(yù)熱的GKN液稀釋成細(xì)胞密度為2×107/mL的牛紅細(xì)胞懸液；分別取懸液1mL到5個(gè)試管中，每個(gè)試管加入0.5mL預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的PEG(Mr=4000)混勻，將試管分別置于33℃、35℃、37℃、39℃、41℃水浴中溫浴15min；取融合后的細(xì)胞觀察并統(tǒng)計(jì)融合率。

1.2.3 細(xì)胞融合時(shí)間的選擇 在最適融合溫度下，分別溫浴5min、8min、13min、15min、17min，取融合后的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)融合率。

1.2.4 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 在最適溫度下，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%的PEG作為促融劑進(jìn)行細(xì)胞融合，在最適融合時(shí)間取融合后的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)融合率。

1.2.5 對(duì)PEG的選擇 在最適溫度下，分別用最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG(Mr=600)、PEG(Mr=1000)、PEG(Mr=2000)、PEG(Mr=4000)、PEG(Mr=6000)作為促融劑進(jìn)行細(xì)胞融合，在最適融合時(shí)間取融合后的細(xì)胞統(tǒng)計(jì)融合率。

1.2.6 細(xì)胞融合率的計(jì)算 每一次計(jì)算融合率時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野。在顯微鏡視野內(nèi)，計(jì)數(shù)觀察到的所有細(xì)胞核數(shù)以及其中已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞的細(xì)胞核數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)之百分比即為融合率。

2 結(jié)果與分析

2.1PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合條件的選擇

2.1.1 細(xì)胞融合溫度 溫度是影響細(xì)胞融合的重要因素。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)溫度不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞的融合率隨著溫度的升高而增加，溫度在39℃時(shí)融合率達(dá)到最大值，為23.24%，繼續(xù)升高融合溫度，融合率呈迅速的下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度升至41℃僅為17.75%(圖1)。因此，融合溫度選擇在35℃～39℃.

2.1.2 細(xì)胞融合時(shí)間 將細(xì)胞融合溫度控制在39℃，融合時(shí)間為15min時(shí)，融合率達(dá)到最大值25.45%，當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)融合時(shí)間時(shí)，融合率并沒(méi)有隨著時(shí)間的增加而增加，至17min時(shí)，融合率為25.34%(圖2)，并且隨著時(shí)間的增加，視野中出現(xiàn)了越來(lái)越多的細(xì)胞破碎現(xiàn)象，表現(xiàn)為觀察到的完整細(xì)胞越來(lái)越少(表1)。因此，融合時(shí)間選擇在8～15 min.

圖1 溫度對(duì)牛紅細(xì)胞融合率的影響

圖2 PEG作用時(shí)間對(duì)牛紅細(xì)胞融合率的影響

2.1.3 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù) 分別用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG作為細(xì)胞融合的促融劑，結(jié)果表明，融合溫度在39℃，融合時(shí)間為15min時(shí)，細(xì)胞融合的效率隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高(圖3)。但是，PEG具有一定的毒性，且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大對(duì)細(xì)胞的毒性越大，極大地影響了融合率和融合后細(xì)胞的存活率[16]，因此，PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇在45%～55%.

2.1.4 PEG的相對(duì)分子質(zhì)量分別用Mr為600、1000、2000、4000、6000的五種PEG來(lái)進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明，在這幾種PEG中，相對(duì)分子質(zhì)量為600的PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的效率最低，只有14.55%，隨著相對(duì)分子質(zhì)量的增加，融合率也增加，到相對(duì)分子質(zhì)量為4000時(shí)，融合率高達(dá)25.73%，當(dāng)PEG的相對(duì)分子質(zhì)量為6000時(shí)，融合率略微升至25.87%(圖4)。考慮到PEG的相對(duì)分子質(zhì)量越大，對(duì)細(xì)胞的毒性也越大，因此，PEG的相對(duì)分子質(zhì)量選擇在1000～4000.

圖3 不同的PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)牛血細(xì)胞融合率的影響

圖4 不同Mr的PEG對(duì)牛紅血細(xì)胞融合率的影響

2.2PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合條件參數(shù)的優(yōu)化和選擇

以融合溫度、融合時(shí)間、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對(duì)分子質(zhì)量分別為實(shí)驗(yàn)因子，每因子分別取3水平作正交實(shí)驗(yàn)。正交因素水平表見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2.

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素表

表2 L9 (34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出：對(duì)細(xì)胞融合率的影響最大的因素是時(shí)間，其次是溫度，然后依次是PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；所以，融合條件的最優(yōu)水平組合是A3B3C3D3.最佳條件重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 最佳條件的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由表3知，最佳條件的重復(fù)性較好，故可確定最佳融合條件：溫度為39℃、時(shí)間為15min、PEG的相對(duì)分子質(zhì)量為4000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，融合率為25.69%.

但是, PEG的相對(duì)分子質(zhì)量越大、質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大，而這兩個(gè)因素相對(duì)而言并不是影響融合率的主要因素，所以，在實(shí)際應(yīng)用中，可以在保證融合效果的前提下，嘗試使用對(duì)細(xì)胞毒性較小的條件。

由于PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)于其他因素而言，對(duì)融合率影響最小，PEG的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)融合率的影響也比較小，所以分別用A1、A2代替A3B3C3D3中的A3，用B1、B2代替A3B3C3D3中的B3，將所得融合率值與表3中理論最佳條件的融合率值進(jìn)行卡方分析，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 選擇條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由表4可知，P(A2B3C3D3)、P(A1B3C3D3)均大于0.05，故在實(shí)踐中可用A2或A1代替A3.如果用A2代替，則可以獲得較多的融合細(xì)胞；如果用A1代替，則可以更大程度地減少對(duì)細(xì)胞的毒害，從減少對(duì)細(xì)胞的毒害這一思想出發(fā)，用A1代替A3更好。P(A3B2C3D3)大于0.05，P(A3B1C3D3)小于0.05，故在實(shí)踐中如用B1代替B3則得到的融合率太低，而可用B2代替B3.

所以，在實(shí)踐上，細(xì)胞融合條件的一種較理想水平組合宜為A1B2C3D3，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 理想選擇條件的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由表5可看到，該理想選擇條件的重復(fù)性較好，故可確定在實(shí)踐中的一種理想融合條件為溫度為39℃、時(shí)間為15min、PEG的相對(duì)分子質(zhì)量為2000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%，融合率為21.26%.

3 討論

融合率在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增大，在39 ℃時(shí)最大，繼續(xù)升高溫度時(shí)不僅融合率下降，而且細(xì)胞狀態(tài)不良。細(xì)胞融合的最適時(shí)間為15 min, 但是隨著融合時(shí)間的延長(zhǎng)，融合率反而有所下降, 這可能是因?yàn)镻EG作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 對(duì)細(xì)胞毒害太大，導(dǎo)致了更多融合細(xì)胞變形甚至破裂所致。

細(xì)胞融合率與PEG的相對(duì)分子質(zhì)量及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比, 但PEG的相對(duì)分子質(zhì)量越大、體積分?jǐn)?shù)越高, 對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者, 在以往實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG相對(duì)分子質(zhì)量一般為4000和6000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為40%～60%。盡管本實(shí)驗(yàn)在選擇范圍內(nèi)所用的PEG當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量為4000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%時(shí)，融合率最高，但是時(shí)間、溫度是影響融合率的主要因素，PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)是次要因素，在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)主要因素選取使綜合平均值最好的水平，對(duì)次要因素可以選取使綜合平均值最好的水平，也可以選取細(xì)胞受毒害較小的水平進(jìn)行最優(yōu)水平組合。用45%的PEG(Mr=2000)取代55%的PEG(Mr=4000)，同樣也得到了很高的融合率21.26%，而且對(duì)細(xì)胞的毒害更小，所以在生產(chǎn)實(shí)踐中較宜選用45%的PEG(Mr=2000)，而不是55%的PEG(Mr=4000)。

PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合受很多因素的影響，只要控制好作用時(shí)間與溫度，將PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、相對(duì)分子質(zhì)量等調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)姆秶?，就能獲得較高的細(xì)胞融合率。當(dāng)然，對(duì)于不同種類細(xì)胞，其最適融合條件之間的差別還有待于進(jìn)一步研究探討。

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Astudyonconditionoptimizationofcell-fusionwithPEGastheRevulsant

YAN Zhen-jun1,ZHANG Xiao-bing2

(1.College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China;2.Huangshi No.18 Middle School,Huangshi 435002,China)

The cell-fusion technique is a core basic technology,as the most frequently revulsant,PEG is widely used in many fields such as agriculture、medicine、environmental protection,and so on. To find a more effective and rapid cell-fusion method that can answer for the cell-engineering needs which need the fused cells to keep more physiological activities better, here, ox red cells were taken as the material, which were made to fuse induced by PEG, the author studied the effects of fusion temperature、PEG role time、PEG molecular weight and mass fraction on cell fusion.The results showed that when the fusion temperature、PEG role time、PEG molecular weight and mass fraction was 39℃、15min、2000、45%,respectively, the fusion frequency reached to the peak value at the same time that the poison to cells was much less，and the cell fusion rate reached to 21.26%.

cell engineering;PEG;the optimum use condition

2013—10—23

嚴(yán)鎮(zhèn)均(1976— )，男，湖北武漢人，講師，研究方向?yàn)檫z傳學(xué).

Q813.2

A

1009-2714(2014)01- 0014- 06

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.01.004