張朝順 柯常江 馮起校 邱海兵 覃善君

深靜脈血栓形成(DVT)指血液在深靜脈內(nèi)不正常地凝結(jié)、阻塞管腔，導(dǎo)致的靜脈回流障礙，多發(fā)生于下肢深靜脈。西方國(guó)家每年因DVT住院人數(shù)約65 萬(wàn)例，死亡人數(shù)約5～20 萬(wàn)例，臺(tái)灣地區(qū)的DVT發(fā)生率約為歐美的2/3，大陸尚無(wú)對(duì)DVT發(fā)病情況的統(tǒng)計(jì)[1]。隨著人口老齡化，DVT發(fā)病率近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)。DVT除可能引致肺栓塞(PTE)外，尚會(huì)導(dǎo)致慢性靜脈功能不全，引起慢性靜脈潰瘍、跛行等，影響患者生活質(zhì)量，加重社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。DVT病變過(guò)程復(fù)雜，為明確其發(fā)病的機(jī)制及轉(zhuǎn)歸，建立合適的DVT動(dòng)物模型，模擬其病理生理過(guò)程，是研究DVT的重要途徑。雖然目前已有多種DVT動(dòng)物模型，但能很好的模擬人類DVT病理生理過(guò)程的動(dòng)物模型仍較少。如何復(fù)制更符合臨床的DVT動(dòng)物模型，是今后推進(jìn)DVT防治研究的關(guān)鍵。我們通過(guò)不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法，建立了一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定且更符合臨床的大鼠DVT疾病模型，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性清潔級(jí)SD大鼠144只，月齡4個(gè)月，體質(zhì)量(350±27)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。SD大鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，室溫18～25℃，房間通風(fēng)良好，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水及進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

二、動(dòng)物分組

144只SD大鼠，按隨機(jī)原則分組，分為6組，每組24只。N組：正常對(duì)照組；S組：假手術(shù)組；V1組：不完全阻滯左股靜脈血流組；V2組：不完全阻滯左股靜脈血流+左下肢制動(dòng)組；V3組：不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水1 ml組；V4組：不完全阻滯左股靜脈血流+注入凝血酶0.25 U(0.1 ml)組。

三、大鼠下肢深靜脈血栓形成模型的建立

N組(正常對(duì)照組)：不作任何操作。 S組(假手術(shù)組)：大鼠以5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，沿左腹股溝區(qū)中點(diǎn)行2 cm縱行切口，分離左股靜脈；術(shù)畢檢查周圍組織無(wú)出血后縫合切口，外敷消毒紗布。V1組：5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，沿左腹股溝區(qū)中點(diǎn)行2 cm縱行切口，分離左股靜脈；在左股靜脈近心端處繞以絲線不完全結(jié)扎，使血管腔縮小約1/2，以減慢血流。V2組：在V1組操作的基礎(chǔ)上，以石膏固定大鼠左下肢制動(dòng)。V3組：在V1組操作的基礎(chǔ)上，自阻滯血管遠(yuǎn)端緩慢注入10%高滲鹽水1 ml造成局部靜脈血管壁損傷(當(dāng)靜脈輸入10%高滲鹽水時(shí)，血漿滲透壓升高，使血管內(nèi)皮細(xì)胞脫水、低氧、充血、水腫，引起血管收縮與痙攣，進(jìn)而使局部血小板聚集，并釋放血栓素A2等，靜脈壁通透性增高，白細(xì)胞浸潤(rùn)并產(chǎn)生炎性改變，從而促進(jìn)靜脈血栓形成[3])。V4組：在V1組操作的基礎(chǔ)上，自阻滯血管遠(yuǎn)端緩慢注入凝血酶0.25 U。術(shù)后動(dòng)物自由飲水，正常飼料飼養(yǎng)，不用抗凝劑及抗生素。

四、標(biāo)本的獲取及處理

建模后第2、6、10日作為觀察時(shí)間點(diǎn)，在各觀察時(shí)間點(diǎn)每組各隨機(jī)取8只大鼠，對(duì)大鼠麻醉(麻醉方法同前)，切取結(jié)扎線下方股靜脈段約2 cm，用生理鹽水沖洗，再將股靜脈段放入10%甲醛溶液中固定，行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變，并計(jì)算血栓形成率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，按非獨(dú)立四格表顯著性界值進(jìn)行判斷，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況

144只受試大鼠中，S組在建模時(shí)因麻醉過(guò)量死亡1只，V4組在建模時(shí)因術(shù)中損傷股動(dòng)脈致失血性休克死亡1只，其余142只大鼠均存活至完成實(shí)驗(yàn)。

二、各組大鼠左下肢腫脹情況

各組大鼠左下肢腫脹情況見(jiàn)表1。

三、各組大鼠股靜脈血栓形成率的比較

光鏡觀察各組大鼠左股靜脈血栓形成結(jié)果見(jiàn)表2。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，N、S組均未見(jiàn)血栓形成；術(shù)后第2日，V1組大鼠股靜脈血栓形成率為0%(0/8)，V2組25%(2/8)，V3組62.5%(5/8)，V4組28.6%(2/7)；術(shù)后第6日，V1組大鼠股靜脈血栓形成率為12.5%(1/8)，V2組50%(4/8)，V3組87.5%(7/8)，V4組62.5%(5/8)；術(shù)后第10日，V1組大鼠股靜脈血栓形成率為25%(2/8)，V2組50%(4/8)，V3組75%(6/8)，V4組37.5%(3/8)。V1組各時(shí)點(diǎn)的血栓形成率與N、S組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為1.422、1.335，P分別為0.233、0.248，均>0.05)。V3組血栓形成率高于N、S、V1、V2、V4組(χ2分別為28.8、27.957、19.048、5.486、4.846，P分別為<0.001、<0.001、<0.001、0.039、0.039，P均<0.05)。V2組血栓形成率高于N、S、V1組(χ2分別為12.632、9.813、5.169，P值分別為0.001、0.002、0.023，P均<0.05)，V4組血栓形成率高于N、S、V1組(χ2分別為10.786、12.778、5.633，P分別為0.001、0.001、0.018，P均<0.05)，而V2、V4兩組的血栓形成率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.016，P=1.0>0.05)。

表1 各組大鼠左下肢腫脹發(fā)生情況(例數(shù))

表2 光鏡觀察大鼠左股靜脈血栓形成結(jié)果(以靜脈數(shù)表示)

四、各組大鼠局部股靜脈的組織形態(tài)學(xué)觀察

N組及S組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)股靜脈血栓形成；光鏡觀察見(jiàn)整個(gè)血管內(nèi)膜表面平整，內(nèi)皮細(xì)胞大小均勻、排列整齊，管腔內(nèi)無(wú)血栓形成，管壁無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A、B)。V3組術(shù)后第2、6、10日，光鏡下股靜脈血栓病理形態(tài)見(jiàn)圖1C、D、E。

討 論

DVT尤其是下肢的DVT作為住院患者的一項(xiàng)嚴(yán)重疾病及常見(jiàn)并發(fā)癥已越來(lái)越受到重視，具有很高的致殘率及致死率[4-5]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，DVT是繼急性冠脈綜合征和中風(fēng)后的第三大心血管疾病，且其發(fā)病率近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)[6]。許多DVT患者并發(fā)PTE和心血管意外從而導(dǎo)致嚴(yán)重后果[7]。因此，深入研究DVT的發(fā)病原因、致病機(jī)制以及相關(guān)的病理生理，對(duì)于改善診治現(xiàn)狀，降低并發(fā)癥發(fā)生及死亡率，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。而建立簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、穩(wěn)定、可靠且符合臨床深靜脈血栓形成特點(diǎn)的DVT動(dòng)物模型是研究該問(wèn)題的基礎(chǔ)。雖然目前已有多種DVT動(dòng)物模型，但有助于對(duì)DVT發(fā)病機(jī)制深入研究的動(dòng)物模型仍較少。如何復(fù)制更符合臨床的DVT動(dòng)物模型，是今后推進(jìn)DVT防治研究的關(guān)鍵。

利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備DVT疾病模型的歷史由來(lái)已久，文獻(xiàn)報(bào)道有近60年的歷史，先后有多達(dá)18種動(dòng)物用于模型制備[8]。理想的動(dòng)物模型應(yīng)具有類似于人類DVT的病因和病程，血栓應(yīng)形成于下腔靜脈至股靜脈段，動(dòng)物能夠站立并且站立時(shí)應(yīng)足夠高以研究類似DVT患者的血流動(dòng)力學(xué)變化，并且動(dòng)物應(yīng)足夠大以能夠進(jìn)行外科治療方面的研究[9]。因此，與小鼠、大鼠、兔等小動(dòng)物比較而言，豬、猴等大動(dòng)物更接近人類的生理特點(diǎn)，可更好地用于DVT研究[10]。但大動(dòng)物存在費(fèi)用高、人員占用多、術(shù)后管理困難等缺點(diǎn)，而且常受倫理方面的約束，限制了廣泛應(yīng)用。而小動(dòng)物可解決上述問(wèn)題，而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于普及。因此，本實(shí)驗(yàn)選取了SD大鼠制備DVT疾病模型。在造模血管選取方面，目前研究已證實(shí)，DVT以下肢最常見(jiàn)，初始血栓形成的主要部位包括髂靜脈、股靜脈、腘靜脈、脛后靜脈、腓靜脈，而PTE的栓子主要來(lái)源于盆腔靜脈、股靜脈和腓靜脈[11]。因此，選擇股靜脈制備DVT模型最理想，更接近臨床靜脈血栓栓塞癥(VTE)的病理生理過(guò)程。有不少學(xué)者報(bào)道左下肢更易發(fā)生DVT，因此本實(shí)驗(yàn)選取大鼠左股靜脈作為建模血管[12-13]。

圖1 各組大鼠局部股靜脈的組織形態(tài)學(xué)觀察(蘇木素-伊紅染色，×100)

19世紀(jì)中期，國(guó)外學(xué)者Virchow提出血流緩慢、靜脈血管內(nèi)皮損傷或功能不全、血液高凝狀態(tài)等三大與靜脈血栓形成密切相關(guān)的基本要素，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討得出靜脈血栓是多種復(fù)雜原因及高危因素共同作用的結(jié)果。當(dāng)前，DVT動(dòng)物模型的制備主要以阻斷靜脈回流、造成血液淤滯誘發(fā)血栓形成為主，注入促凝物質(zhì)或(和)機(jī)械性損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞為輔。雖然目前已有的建模方法各有特點(diǎn)，但均與臨床實(shí)際不盡相符，如：①臨床DVT絕大部分為亞急性或慢性，而現(xiàn)有建模方法所形成的血栓均為急性；②現(xiàn)有建模方法多為完全結(jié)扎靜脈以阻斷靜脈回流、造成血液淤滯而誘發(fā)血栓形成，這樣雖然可以形成穩(wěn)定的血栓，但是不能保障血栓的近心端通暢，不適合作為對(duì)溶栓及抗血栓藥物動(dòng)態(tài)研究的模型，也不符合人體靜脈血栓的發(fā)病特點(diǎn)(臨床絕大多數(shù)DVT發(fā)病初始并不存在靜脈回流完全阻斷)；③電流損傷法、機(jī)械損傷法等均直接損傷靜脈，與臨床DVT幾乎都未直接損傷深靜脈不相符，且創(chuàng)傷性均較大，易引起全身應(yīng)激狀態(tài)而對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮斐筛蓴_，不符合自然狀態(tài)下的深靜脈血栓形成過(guò)程；④注入促凝物質(zhì)法與臨床DVT患者多無(wú)使用促凝血藥史不相符，且部分患者在使用抗凝血藥時(shí)仍發(fā)生DVT。因此，有必要探索新的建模方法以制備出更符合臨床的DVT動(dòng)物模型。

本試驗(yàn)通過(guò)部分結(jié)扎不完全阻滯左股靜脈血流(環(huán)形縮窄左股靜脈管腔約1/2限流)、不完全阻滯左股靜脈血流+左下肢制動(dòng)、不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水1 ml、不完全阻滯左股靜脈血流+注入凝血酶0.25 U等方法制備DVT大鼠模型，致力于篩選出一種更穩(wěn)定、更符合臨床的DVT動(dòng)物模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①單純通過(guò)部分結(jié)扎不完全阻滯左股靜脈血流(V1組)造模的血栓形成率低，與對(duì)照組(N組)及假手術(shù)組(S組)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與目前多數(shù)研究結(jié)果一致，表明DVT是多種因素共同作用的結(jié)果。②不完全阻滯左股靜脈血流+左下肢制動(dòng)(V2組)、不完全阻滯左股靜脈血流+注入凝血酶0.25 U(V4組)造模的血栓形成率雖然高于N、S組，但仍不夠穩(wěn)定。其中V4組靜脈血栓形成不穩(wěn)定的原因可能是大鼠股靜脈血流未被完全阻滯，導(dǎo)致凝血酶迅速被運(yùn)送到全身，局部被稀釋所致。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)V4組形成的血栓為凝血酶注射所致的急性混合性血栓，與臨床實(shí)際形成的血栓在性質(zhì)和成分上有很大不同，不能很好的模擬臨床DVT的病理生理演變過(guò)程。③不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水損傷局部靜脈血管壁(V3組)造模的血栓形成率高，形成血栓穩(wěn)定可靠。與完全結(jié)扎的模型相比，此模型更符合人體DVT的病理生理學(xué)演變，且形成血栓的血管段近心端保持通暢，可有效地用于觀察藥物溶栓或抗栓塞作用的效果。與電流損傷法、機(jī)械損傷法等直接損傷靜脈的造模方法相比，注入高滲鹽水對(duì)靜脈損傷較小，更符合臨床DVT的發(fā)病特點(diǎn)。且光鏡觀察見(jiàn)V3組不同時(shí)間點(diǎn)形成的血栓與臨床實(shí)際形成的血栓在性質(zhì)和成分上相似，能很好的模擬臨床DVT的病理生理演變過(guò)程。

綜上所述，通過(guò)不完全阻滯股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法，可以建立穩(wěn)定的大鼠DVT疾病模型，與完全結(jié)扎的模型比較，此模型更符合人體DVT的病理生理學(xué)演變，更適用于DVT的基礎(chǔ)研究。

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