楊明煒 王志偉 陸付耳 劉艷娟

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結合研究所，武漢 430030

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是糖尿病、肥胖、原發(fā)性高血壓、高脂血癥、冠心病等多種疾病的共同病理生理學基礎[1]，因此，IR的發(fā)病機制研究以及改善IR的藥物探索一直是近年來醫(yī)學領域研究的熱點。近年來，研究發(fā)現(xiàn)胰島素信號轉導障礙、脂肪源性細胞因子表達異常在IR發(fā)生過程中扮演了重要的角色，而且越來越多的研究認為脂肪組織是IR產生的始發(fā)部位[2]。本實驗通過觀察比較黃連、生地及其配伍含藥血清對IR 3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素與瘦素分泌的影響，從脂肪細胞因子途徑探討黃連、生地及其配伍改善IR的作用機制，并通過比較黃連、生地及其配伍對上述脂肪細胞因子作用的選擇性或協(xié)同性，揭示黃連生地藥對的配伍原理。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物

3T3-L1小鼠前脂肪細胞株購自于中國科學院細胞庫。雄性Wistar大鼠24只(SPF級)，購自湖北省實驗動物研究中心，體重約220 g。

1.2 受試藥品

羅格列酮、胰島素、地塞米松與牛血清蛋白(BSA)購自美國Sigma公司，胎牛血清與DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液購自Thermo公司；葡萄糖測定試劑盒(葡萄糖氧化酶法)購自上海名典生物工程有限公司，ELISA試劑盒購自CUSABIO公司。

1.3 含藥血清的制備

選擇雄性Wistar大鼠40只，SPF級，適應性普通喂養(yǎng)2周后，體重約達(330±15)g。將所有大鼠隨機分為黃連組、生地組、黃連+生地組和空白血清組，每組10只，藥物干預組大鼠分別灌服相應劑量的中藥湯劑，其中黃連1.58 g/kg，生地0.63 g/kg(黃連、生地的劑量分別為臨床劑量的60倍)，空白血清組大鼠灌服相同劑量的生理鹽水。每組灌胃2次/d，8 h/次，期間禁食不禁水，第3天灌胃結束1 h后，于無菌條件下腹主動脈取血，然后放入臺式高速離心機3 000 r/min離心15 min，取血清，將其放入56 ℃恒溫水浴鍋滅活，-20 ℃冰箱保存1個月內用完。

1.4 前脂肪細胞的培養(yǎng)和誘導分化

按文獻[3]所述，將3T3-L1前脂肪細胞接種于24孔培養(yǎng)板，用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d換液。待細胞完全融合后繼續(xù)接觸抑制2 d，換以含0.5 mmol/L IBMX，0.25 μmol/L地塞米松，1 μg/ml胰島素的10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，換以含1 μg/ml胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后以10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分化8～10 d的細胞表現(xiàn)為成熟脂肪細胞表型，可用于實驗。

1.5 模型的建立及分組處理

將誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞換上含2 g/L BSA的DMEM無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，分別換上含25 mmol/L葡萄糖，0.6 nmol/L胰島素，10 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)18 h，完成IR細胞模型的建立[4]。將IR細胞分為模型組及各藥物干預組，藥物干預組分為羅格列酮組、黃連組、生地組及黃連+生地組，分別以馬來酸羅格列酮(Rosiglitazone Maleate)溶液、黃連含藥血清、生地含藥血清及黃連、生地配伍含藥血清進行干預24 h，另設空白血清對照組(以不含藥血清進行干預)及正常組(正常脂肪細胞)。收集各組細胞培養(yǎng)液上清，檢測相關指標。

1.6 葡萄糖消耗實驗

以葡萄糖氧化酶法檢測每孔培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，與未接種細胞的空白孔的糖含量均值相減，計算葡萄糖的消耗量。

1.7 檢測細胞脂聯(lián)素與瘦素的分泌水平

采用ELISA法檢測。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 黃連、生地及其配伍含藥血清對IR 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

與正常組比較，模型組葡萄糖消耗量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，空白血清組葡萄糖消耗量無明顯變化(P>0.05)，黃連組、生地組、黃連+生地組、羅格列酮組葡萄糖消耗量顯著增加(P<0.01)，其中黃連+生地組葡萄糖消耗量明顯大于黃連、生地各單藥組(P<0.01)。見表1。

表1 各組細胞葡萄糖消耗量的比較

2.2 黃連、生地及其配伍含藥血清對IR 3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素與瘦素分泌的影響

與正常組比較，模型組脂聯(lián)素水平顯著降低(P<0.01)，瘦素水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，生地組、黃連+生地組脂聯(lián)素分泌顯著升高(P<0.01)，瘦素分泌顯著降低(P<0.05，P<0.01)，黃連組脂聯(lián)素、瘦素分泌均無顯著差異(P>0.05)，其中黃連+生地組脂聯(lián)素、瘦素分泌與單藥生地組無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞脂聯(lián)素與瘦素分泌水平的比較

3 討論

IR是2型糖尿病、代謝綜合征、心腦血管病等重大慢性疾病發(fā)病的共同病理生理學基礎，其本質為單位胰島素的生物效應降低，研究表明，IR常先于上述多種疾病而先行存在多年，因此，早期發(fā)現(xiàn)并改善IR具有重大的臨床意義。脂肪組織與IR的關系已經成為國內外專家研究的重要課題，其分泌的多種脂肪細胞因子和炎癥因子已被證明與IR的發(fā)生發(fā)展具有相當緊密的聯(lián)系，其中，脂聯(lián)素為脂肪組織分泌的一種分子量為28 kD的凝膠結合蛋白，具有提高葡萄糖攝取、促進糖代謝、抑制內皮細胞炎癥、改善IR、增加脂肪酸氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎的作用[5-6]，脂聯(lián)素水平與改善IR程度密切相關，脂聯(lián)素水平升高可增加胰島素敏感性，明顯改善IR，反之脂聯(lián)素水平減低甚至可能是2型糖尿病的預報因子。瘦素是肥胖基因(ob-gene)的蛋白產物，作為一種代謝激素，瘦素可對一系列的代謝過程產生影響，如胰島素釋放、葡萄糖的產生、轉運、代謝及脂肪的分解、合成等[7]，研究[8]顯示，2型糖尿病患者的血清瘦素水平與IR密切相關。

中醫(yī)古代文獻中雖無IR的記載，但對于IR相關疾病的診治有著系統(tǒng)的理論知識和豐富的臨床經驗，尤其是對于糖尿病(中醫(yī)稱之為“消渴”，其基本病機為陰虛燥熱)的治療，歷代醫(yī)家總結出了大量有效驗方。近年來，醫(yī)者對這些驗方進行比較分析，發(fā)現(xiàn)大多含有黃連、生地二味中藥(其中生地還被譽為治療糖尿病四大“圣藥”之一)，黃連、生地配伍是臨床上治療糖尿病最常用的藥對之一，其源自于孫思邈《千金要方》，稱之為黃連丸，方中黃連清熱為君，生地滋陰為臣，共奏滋陰清熱之功效，主治消渴。臨床實踐[9-11]表明以黃連丸為基本方的一些制劑治療2型糖尿病具有良好療效，初步實驗研究[12]表明，黃連丸具有明顯的降糖作用。由于IR貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過程，故多數(shù)學者推測中醫(yī)藥治療2型糖尿病的主要機制與改善IR有關，并對此進行了大量研究。同時，由于“藥有個性之特長，方有合群之妙用”，“七情合和”、“君臣佐使”等配伍理論是在歷代醫(yī)藥學家廣泛實踐的基礎上發(fā)展成熟的，有著深刻的科學內涵，提示黃連伍用生地應有協(xié)同作用，其協(xié)同作用的機制何在目前卻不清楚，也是亟待解答的問題。

本研究結果表明，黃連、生地及其配伍能夠提高IR脂肪細胞葡萄糖消耗能力，且配伍效果更好，能促進IR脂肪細胞脂聯(lián)素的分泌，減少瘦素的分泌，這可能是上述藥物改善IR的作用機制之一。此外，結果還表明，黃連、生地配伍改善IR的作用環(huán)節(jié)較各單藥組更廣泛，作用強度較各單藥組更強，提示黃連生地配伍對上述脂肪細胞因子的影響具有協(xié)同作用，說明黃連生地配伍具有科學性。

[1] REAVEN GM.Insulin resistance，the insulin resistance syndrome，and cardiovascular disease[J].Panminerva Med，2005，47(4)：201-210.

[2] HOTAMISLIGIL GS.Molecular mechanisms of insulin resistance and the role of the adipocyte[J].Int J Obes Relat Metab Disord，2000，24 Suppl 4：S23-27.Review.

[3] NELSON BA，ROBINSON KA，BUSE MG.High glucose and glucosamine induce insulin resistance via different mechanisms in 3T3-L1 adipocytes[J].Diabetes，2000，49(6)：981-991.

[4] 易屏，陸付耳，陳廣，等.小檗堿對3T3-L1胰島素抵抗細胞模型PI-3K p85蛋白表達的影響[J].世界華人消化雜志，2008，16(19)：2102-2106.

[5] 劉軍，陳影，劉芳，等.2型糖尿病家系非糖尿病一級親屬脂聯(lián)素水平與胰島素抵抗和動脈粥樣硬化相關性的研究[J].中華內分泌代謝雜志，2004，20(3)：215-216.

[6] YAMAUCHI T，KAMON J，WAKI H，et al.The fat-deriv edhormoneadiponectin reverses insulin resistance associated with bothlipoatrophy and obesity[J].Nat Med，2001，7(8)：941-946.

[7] MORRIS DL，RUI L.Recent advances in understanding leptin signa-ling and leptin resistance[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297(6)：E1247-E1259.

[8] 陳敏，方小正，李紅.2型糖尿病患者瘦素水平與胰島素抵抗關系的研究[J].中國綜合臨床，2008，24(3)：251-253.

[9] 王忠琳.黃連地黃湯治療Ⅱ型糖尿病的研究[J].山東中醫(yī)藥大學學報，1995，19(3)：185-189.

[10] 張秋莉.自擬黃連生地飲治療Ⅱ型糖尿病108例[J].中醫(yī)藥信息，1998，15(1)：26.

[11] 龐存生，李宗德，褚玉明.秘傳黃連地黃湯加減治療糖尿病36例[J].甘肅中醫(yī)學院學報，2001，18(3)：27-28.

[12] 李真，馬高峰.生地黃連液對四氧嘧啶小鼠影響的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2000，27(12)：573.