徐娜娜　李鵬昌　于金鳳

摘要：根據(jù)小麥紋枯病菌Rhizoctonia cerealis AG-D融合群ITS區(qū)的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)WKF-8/WKR-8， 對(duì)引物的特異性和靈敏性進(jìn)行檢測(cè)，建立并優(yōu)化基于SYBR GreenⅠ熒光染料法的real-time PCR 反應(yīng)體系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)范圍在1.0×10-3～10 ng/μl之間有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.995，擴(kuò)增效率為99.7%，靈敏度比常規(guī)PCR 方法高100倍。結(jié)果表明，該方法具有快速、特異性強(qiáng)、敏感度高等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：小麥紋枯病菌；SYBR GreenⅠ熒光染色法；real-time PCR

中圖分類號(hào)：S435.12：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）03-0106-04

AbstractA pair of specific primers， WKF-8/WKR-8， were designed according to the DNA sequence of the internal transcribed spacers （ITS） region of Rhizoctonia cerealis AG-D fusion group. Their specificity and sensitivity were detected. A real-time polymerase chain reaction system was developed and optimized based on SYBR GreenⅠfluorescent staining method. And the standard curve was drawn. A good linear relationship between the template DNA amount and cycle threshold （Ct） value was observed in the range of 1.0×10-3～10 ng/μl. The correlation coefficient was 0.995， and the amplification efficiency was 99.7%. The sensitivity was 100 times higher than that of conventional PCR. The results showed that this method had characteristics of speediness， high sensitivity and specificity.

Key wordsRhizoctonia cerealis； SYBR Green Ⅰ fluorescent staining method； Real-time PCR

小麥在國家糧食安全和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展中占有重要地位[1]。小麥紋枯病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重發(fā)生的小麥病害之一。我國于1973年發(fā)現(xiàn)小麥紋枯病，近年來，隨著小麥品種、栽培制度、肥水條件等的改變，紋枯病發(fā)生危害逐漸加重，已成為影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重大障礙[2]。陳瑩、賈廷祥等的研究表明我國小麥紋枯病的優(yōu)勢(shì)致病群為AG-D融合群[3，4]。綜合考慮和分析災(zāi)害對(duì)小麥產(chǎn)量的影響是小麥生產(chǎn)災(zāi)害診斷與預(yù)防的關(guān)鍵[5]。

目前對(duì)土壤中小麥紋枯病菌定量檢測(cè)的方法主要是傳統(tǒng)的活體分離、培養(yǎng)獲得菌株或者使用土壤浸出液涂板，促使土壤中的病原菌形成肉眼可見的單菌落，從而估計(jì)出土壤中禾谷絲核菌的量。傳統(tǒng)檢測(cè)方法受人為影響大，可重復(fù)性低，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。近年來分子生物學(xué)的快速發(fā)展使得對(duì)病害的早期快速檢測(cè)成為可能，并開始應(yīng)用于紋枯病菌的早期診斷。張廷婷[6]于2012年采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)了花生種皮抗黃曲霉基因表達(dá)強(qiáng)度。Lees等[7]采用real-time PCR的方法，利用特異性引物對(duì)土壤中馬鈴薯黑痣病菌AG-3融合群進(jìn)行了定量檢測(cè)。Sayler和Yang[8]也從感病水稻植株上，定量檢測(cè)了水稻紋枯病菌AG1-IA融合群。方正[9]用兩對(duì)特異性引物從感染小麥紋枯病菌的植株莖基部DNA中擴(kuò)增到了約480 bp的特異性分子片段，可用于對(duì)小麥紋枯病的早期快速診斷和對(duì)病害的監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)。

本研究通過比較普通PCR和real-time PCR方法在檢測(cè)小麥紋枯病方面的優(yōu)缺點(diǎn)，試圖建立土壤中小麥紋枯病菌的real-time PCR方法，以定量測(cè)定土壤中小麥紋枯病菌自然潛育狀態(tài)下的侵染量，為該病害的早期預(yù)測(cè)和防治措施的制定提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

小麥紋枯病菌相關(guān)菌株分離于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥試驗(yàn)基地罹病組織，玉米紋枯病菌、棉花立枯病菌、馬鈴薯黑痣病菌、鐮刀菌、蠕孢菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2菌株DNA的提取與標(biāo)準(zhǔn)品制備

挑取目的菌株菌絲塊于附有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，刮取菌絲，采用CTAB法[10]提取小麥紋枯病菌、玉米紋枯病菌、棉花立枯病菌、馬鈴薯黑痣病菌以及引起小麥莖基腐病的鐮刀菌和蠕孢菌的DNA。以小麥紋枯病菌WK-206菌株的DNA為標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行梯度稀釋（1.0×10-6～1.0×102 ng/μl）。

1.3引物設(shè)計(jì)合成

小麥紋枯病菌DNA經(jīng)克隆測(cè)序，獲得ITS區(qū)序列?；贗TS區(qū)序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件DNAman和Primer 5設(shè)計(jì)小麥紋枯病菌的特異性引物對(duì)WKF-8/WKR-8，由上海生工生物工程有限公司合成，并通過常規(guī)PCR和real-time PCR對(duì)引物的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

目前，對(duì)于土壤中小麥紋枯病菌的研究方法主要是微生物純培養(yǎng)法，獲得病原菌群落豐富的多樣性。然而隨著人們對(duì)土壤中微生物的原位生存狀態(tài)研究，發(fā)現(xiàn)常規(guī)分離培養(yǎng)方法難以實(shí)現(xiàn)病原菌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[13]。新興的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、快速高效，且高度敏感性等特點(diǎn)[14]，因此適合于檢測(cè)環(huán)境中微生物在時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)變化。endprint

本研究根據(jù)real-time PCR的特點(diǎn)，基于ITS區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)小麥紋枯病菌的特異性引物，特異性檢測(cè)結(jié)果良好，使用最優(yōu)化的real-time PCR體系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)待測(cè)樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2為0.995，完全適用于對(duì)該菌的定量檢測(cè)，最低檢測(cè)下限是1.0×10-5 ng/μl，比常規(guī)PCR高出100倍，結(jié)果穩(wěn)定可靠。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)迅速，能很好地用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測(cè)，對(duì)掌握病害發(fā)生發(fā)展及流行以及指導(dǎo)病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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本研究根據(jù)real-time PCR的特點(diǎn)，基于ITS區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)小麥紋枯病菌的特異性引物，特異性檢測(cè)結(jié)果良好，使用最優(yōu)化的real-time PCR體系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)待測(cè)樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2為0.995，完全適用于對(duì)該菌的定量檢測(cè)，最低檢測(cè)下限是1.0×10-5 ng/μl，比常規(guī)PCR高出100倍，結(jié)果穩(wěn)定可靠。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)迅速，能很好地用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測(cè)，對(duì)掌握病害發(fā)生發(fā)展及流行以及指導(dǎo)病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)具有重要意義。

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本研究根據(jù)real-time PCR的特點(diǎn)，基于ITS區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)小麥紋枯病菌的特異性引物，特異性檢測(cè)結(jié)果良好，使用最優(yōu)化的real-time PCR體系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)待測(cè)樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2為0.995，完全適用于對(duì)該菌的定量檢測(cè)，最低檢測(cè)下限是1.0×10-5 ng/μl，比常規(guī)PCR高出100倍，結(jié)果穩(wěn)定可靠。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)迅速，能很好地用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測(cè)，對(duì)掌握病害發(fā)生發(fā)展及流行以及指導(dǎo)病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)具有重要意義。

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