朱平川，岑衛(wèi)健，范曉蘇

（1.亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室（廣西大學），廣西 南寧530004；2.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧530004）

王老吉涼茶是著名的廣東涼茶之一，由金銀花、菊花、仙草、雞蛋花、夏枯草、布渣葉和甘草7味藥材組成，具有清熱解毒、涼血排毒等功效.2006年國務院將涼茶批準為國家級非物質文化遺產［1］.涼茶中含有多種中藥有效成分，綠原酸具有顯著的抗氧化、降血糖血壓以及抗菌消炎、抗腫瘤等多種藥理活性［2］，異綠原酸具有抗菌、抗炎、促凝血、抗氧化以及降血脂等作用［3］，甘草酸屬于皂苷類成分，甘草酸能達到增加人體免疫功能作用［4］，但目前對涼茶中藥有效成分的報道比較少，且大多采用液相色譜法［5］.曹英華等采用高效液相色譜法測定［6］涼茶中綠原酸、新橙皮苷、甘草酸的含量，鄧潔薇［7］對鄧老涼茶顆粒進行了的HPLC指紋圖譜研究.在涼茶以及其他飲料中的綠原酸、異綠原酸C、甘草酸這3種物質含量的同時分析研究尚少見有報道.

色譜-質譜聯(lián)用技術具有專屬靈敏、快速等特點，已成功用于成分測定［8］，液相色譜-質譜聯(lián)用技術更是成分分析中定性和定量分析的有力工具［9-10］，并且越來越廣泛地運用于食品與飲料中的成分研究［11］，本工作建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時檢測這3種物質含量的方法，該方法準確、簡便快速，已成功地用于實際樣品的分析.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 儀器：1290Infinity LC System，6460Triple Quad LC／MS，美國Agilent公司；ME 215S電子天平，德國Sartorius公司；Eppendorf Centrifuge 5810R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；KQ2200DV超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.試劑：甲醇、乙腈、甲酸（色譜純），美國Fisher公司，對照品綠原酸、異綠原酸C、甘草酸（四川省維克奇生物科技有限公司），實驗用水為超純水；樣品王老吉涼茶（廣州王老吉健康產業(yè)有限公司）.

1.2 溶液配制 對照品儲備液：準確稱取綠原酸、異綠原酸C、甘草酸對照品各10.0mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成1.00mg／mL儲備液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀釋到所需的濃度.

樣品溶液：準確量取王老吉涼茶1mL，用甲醇稀釋10倍，取稀釋的樣品1mL置于1.5mL的EP管中，于12 000rpm下離心10min，經0.22μm的微孔過濾膜過濾即可作為樣品溶液.

1.3 色譜條件 采用 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（2.1×50.0mm，1.8μm）色譜柱；以含甲醇（A）-0.1%甲酸的水溶液（B）為流動相，梯度洗脫程序：0～3min，90%～55%B；3.0～4.5min，55%～30%B；4.5～6.0min，30%～10%B；6～8min，10%～0%B；8～9min，0%B；9～10min，0%～90%B.流速為0.30mL／min，進樣量：1μL.

1.4 質譜條件 離子源為電噴霧電離源，干燥氣體，霧化氣體，鞘氣氣體均為N2，毛細管電壓為4 000 V，噴嘴電壓為0V.采用多重反應監(jiān)測模式（MRM），3種目標組分的其他質譜分析參數見表1.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化 對甲醇-水和乙腈-水流動相進行了考察，結果表明使用甲醇-水體系作流動相時靈敏度高于乙腈-水體系，且分離效果更好.當流動相中不添加甲酸時，綠原酸、異綠原酸C兩個物質峰有嚴重的拖尾，且同時發(fā)現(xiàn)添加的甲酸的濃度會影響各組分的檢測靈敏度，本方法采用在流動相甲醇-0.1%甲酸水為流動相進行梯度洗脫.

2.2 質譜條件的優(yōu)化 分別對比了正離子和負離子檢測模式，發(fā)現(xiàn)在實驗條件下采用綠原酸、異綠原酸C在負離子模式下檢測靈敏度高，而甘草酸在正離子模式的檢測靈敏度較高.在MRM模式下，對選定的各待測物的母離子和定量子離子進行各種參數的優(yōu)化，結果見表1.

表1 3種成分的部分質譜分析參數

2.3 色譜與質譜行為 在優(yōu)化的色譜質譜條件下，被測組分間可獲得良好的分離，色譜圖見1.根據峰的保留時間及質譜信息進行定性，二級質譜特征離子圖譜見圖2.從圖2中，可以看出綠原酸、異綠原酸C分子離子峰為［M-H］-、甘草酸的分子離子峰為［M＋Na］＋；從圖2中選出各物質響應最強且穩(wěn)定的子離子作為定量子離子，因此進行多重反應監(jiān)測時，分別對綠原酸（m／z為191.1）、異綠原酸C（m／z為353.0）、甘草酸（m／z為669.3）的碎片離子進行監(jiān)測.

圖1 對照品（A）和樣品（B）的MRM色譜圖

圖2 3種標準品的二級質譜圖

表2 3種組分的線性方程、相關系數、線性范圍及檢出限

2.4 線性關系及檢出限精密吸取3種對照品的儲備液，甲醇溶液稀釋，配制一系列不同質量濃度的對照品，混合，在優(yōu)化的實驗條件下測定，重復3次.以被測組分質量濃度為橫坐標，峰面積的平均值為縱坐標進行線性回歸，以信噪比（S／N）等于3為標準，測得3種待測組分的檢出限，見表2，從表中可看出，各化合物的響應值與濃度間均呈現(xiàn)良好的線性關系.

2.5 精密度、穩(wěn)定性以及重復性 取同一批次待測樣品，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化的實驗條件下連續(xù)進樣6次測定，相對標準偏差（RSD）為1.2%～1.8%，結果表明該方法有較好的精密度.

取同一批次樣品，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化后的實驗條件下，分別于0，2，4，6，8，10h進樣測定，相對標準偏差（RSD）為1.3%～2.1%，結果表明供試品溶液在10h內穩(wěn)定.

同一批次待測樣品隨機取6份，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化的實驗條件下分析，相對標準偏差（RSD）為1.6%～2.5%.結果表明供試樣品重復性良好.

2.6 加標回收率試驗 分別精密量取已知這3種組分含量的同一批次王老吉涼茶各1mL，共9份，每組3份，按“1.2”供試樣品溶液的制備方法將樣品稀釋10倍來制備樣品溶液，加入高、中、低3個質量濃度的混合標準品.在最優(yōu)化實驗條件下分析.3種成分的平均回收率根據峰面積代入回歸方程計算得出，具體數據見表3.在添加3個質量濃度的水平下，3種成分的加標回收率為94.7%～103%，RSD均不大于1.9%，可以滿足實際樣品的測定要求.

表3 3種組分在樣品中的加標回收率（n＝3）

2.7 樣品分析 分別精密稱取不同批次的樣品，按“1.2”下供試樣品溶液的方法制備樣品溶液，按上述優(yōu)化好的條件進行樣品測定，把各組分峰面積代入回歸方程計算得到樣品中3種組分的含量，結果見表4.實驗結果表明，該方法可用于綠原酸、異綠原酸C、甘草酸3種有效成分含量的同時測定.

表4 樣品測定結果

3 結論

采用UPLC-MS／MS技術建立了同時測定王老吉涼茶中綠原酸、異綠原酸C、甘草酸3種藥效成分含量的分析方法.實驗結果表明，該方法具有靈敏度好、定量能力強、準確度高、快速、簡單的特點，已成功用于王老吉涼茶中上述3種有效成分含量的同時測定，可以為王老吉涼茶的質量控制和中草藥療效以及藥代動力學等相關研究提供新的參考方法.

［1］王萍，肖更生，張友勝，等.廣式涼茶研究進展［J］.食品科技，2010，35（2）：77-80.

［2］張鞍靈，馬瓊，高錦明.綠原酸及其類似物與生理作用［J］.中草藥，2001，32（2）：173-176.

［3］李祖晟，朱志安.二咖啡酰奎寧酸藥理實驗研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2004，10（4）：249.

［4］田慶來，官月平，張波，等.甘草有效成分的藥理作用研究進展［J］.天然產物研究與開發(fā)，2006，18：343-347.

［5］郝媛媛，譚波濤，丁軼聰，等.高效液相色譜法測定涼茶飲料中甘草酸的含量［J］.安徽農業(yè)科學，2012，40（3）：1459-1460.

［6］曹英華，賈麗，夏敏，等.高效液相色譜法測定涼茶中綠原酸、新橙皮苷、甘草酸的含量［J］.現(xiàn)代科學儀器，2012，12（6）：112-114.

［7］鄧潔薇，張翠仙，李娜，等.鄧老涼茶顆粒的 HPLC指紋圖譜及模式識別研究［J］.中草藥，2011，42（11）：2231-2234.

［8］覃莎，王錦，徐遠金.超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定加味左金丸中的9種有效成分［J］.色譜，2012，30（11）：1153-1158.

［9］張亞中.基于超高效液相-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜的白花蛇舌草注射液主成分分析［J］.中草藥，2013，44（4）：829-833.

［10］趙燕華，林妮妮，郭磊，等.固相萃取-超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術檢測大鼠血漿中T-2毒素及其主要代謝產物［J］.分析化學，2012，40（12）：1852-1856.

［11］周春紅，朱書強，王榮.LC-MS／MS在食品安全分析中的應用［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（2）：431-435.