吳明煜，柯文山，劉旭，黃麗陶，王萬賢，郭曉紅

（1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430062；2.武漢生物工程學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，湖北 武漢430415）

0 引言

作為日本血吸蟲（Schistosomajaponicun）的唯一中間寄主，釘螺（Oncomelaniahupensis）是血吸蟲病傳播唯一和最脆弱的一環(huán)，滅螺能有效地降低血吸蟲?。╯chistosomiasis）的傳播［1］.隨著全球氣候變暖，流行區(qū)人流物流急劇增加，血防工作仍舊面臨嚴(yán)峻的形勢［2-3］.已發(fā)現(xiàn)多種植物能毒殺釘螺，其中的有效成分分屬萜類化合物、皂苷類、鞣質(zhì)、生物堿類、（異）黃酮類、呋喃、萘醌、香豆素等［4-6］.蛇床子為傘形科植物蛇床（Cnidiummonnieri（L.）Cuss.）的果實(shí)［7］.蛇床子不僅在臨床上有止咳、鎮(zhèn)痛、抗菌等功效，也具殺蟲作用［7-9］.本研究分離獲得蛇床子總香豆素，用其水溶液進(jìn)行殺螺實(shí)驗(yàn)，同時比較不同濃度總香豆素對釘螺體內(nèi)酯酶同工酶及糖原含量的影響，以揭示蛇床子總香豆素的殺螺機(jī)理.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 釘螺采自湖南省洞庭湖區(qū)，選取成螺為7～8旋，逸幼法去掉陽性螺［10］，喂養(yǎng)在無氯清水中.實(shí)驗(yàn)用蛇床子生藥材購自武漢市神草中藥飲品有限責(zé)任公司.

1.2 蛇床子總香豆素的提取 將蛇床子生藥材除塵去雜后置烘箱內(nèi)50℃烘干至衡重，機(jī)械粉碎成粗粉.稱取蛇床子粗粉1 000g，用8倍量丙酮室溫下浸提3次，每次3d.合并濾液，減壓濃縮至無丙酮，得深綠色稠狀物，用5倍量石油醚稀釋，靜置24h.將不溶性粘稠物用石油醚多次熱溶解，冷凍析晶；石油醚溶液蒸餾去除石油醚，得深綠色稠狀物，加入1倍量NaOH（2mol／L），10倍水稀釋，靜置析晶［11］.合并兩部分結(jié)晶即得蛇床子總香豆素（TCFC）16g.

1.3 蛇床子總香豆素浸殺實(shí)驗(yàn) 先取適量蛇床子總香豆素1mL乙醇溶解，然后按照等比稀釋法以無氯水分別配制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg／L共6個不同濃度梯度的處理藥液各1 000 mL.4袋釘螺（每袋15只）分別投入每個含處理藥液的玻璃缸中.處理24、48、72、96h后，每缸中釘螺隨機(jī)取出1袋，無氯清水沖洗后，觀察死活.24h內(nèi)開靨爬行即為活螺，余下者用觸刺或解剖方法鑒別死活.另在1 000mL無氯水中滴加1mL無水乙醇作為對照.所有的處理均設(shè)定3次重復(fù)，在（25±1）℃下進(jìn)行，并統(tǒng)計不同處理下的釘螺死亡率.

1.4 酯酶同工酶電泳分析夾竹桃強(qiáng)心總甙對釘螺軟體組織質(zhì)量的影響 按照LC50配置蛇床子總香豆素藥液.并投入4袋釘螺，每袋20只.釘螺處理1、2、3、4d后，隨機(jī)選一袋，取出活螺，并用無氯清水漂洗3～4h后，吸干水分后，敲碎螺殼，取出釘螺的肝臟部分，加3滴磷酸緩沖液冰浴勻漿，勻漿液0℃下（10 000r／min，20min）離心.電泳樣品包括取上清液、0.3mL 40%蔗糖以及0.1%的溴酚藍(lán)2滴.對照組為正常飼養(yǎng)螺.聚丙烯酰胺垂直板進(jìn)行電泳［12-13］.

1.5 蛇床子總香豆素對釘螺軟體組織質(zhì)量和釘螺糖原的影響 按照LC50配置蛇床子總香豆素藥液.每組成螺30只（大小相當(dāng)），分別浸殺1、2、3、4d后用無氯清水漂洗，吸干水分后敲碎螺殼，取出整個軟體組織，稱量濕重，烘箱常溫吹干，稱量干重后磨粉.每次取樣（干粉）15mg，糖原制備按文獻(xiàn)［14］進(jìn)行.糖原含量測定采用蒽酮顯色法［14］.配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線.721分光光度計在620nm處測定糖原制備液吸光值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算糖原濃度.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.6 數(shù)據(jù)處理分析 采用SPSS軟件進(jìn)行雙因素方差分析（two-factors analysis of variance），顯著水平α＝0.05.

2 結(jié)果

2.1 蛇床子總香豆素殺螺活性 蛇床子總香豆素水溶液濃度以及處理時間都極顯著地提高了釘螺死亡率（P＜0.01），且藥液濃度與處理時間對釘螺死亡率的影響存在極顯著的交互效應(yīng)（P＜0.01）.釘螺浸殺96h的結(jié)果（圖1）顯示：1.25mg／L和2.50mg／L兩個濃度在72h都達(dá)到了過半的致死率（66.67%和77.78%）；10mg／L以上的蛇床子總香豆素藥液具有100%的明顯毒殺釘螺致死效果.對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行概率單位回歸分析，48h、72h、96h的LC50分別為4.64、0.50、0.31mg／L，相應(yīng)的95%置信區(qū)間為3.58～5.88、0.10～1.02、0.03～0.72mg／L.LC90為27.49、8.24、3.12mg／L，其相對應(yīng)的95%置信區(qū)間為19.14～46.80、5.29～17.09、1.88～5.26mg／L.

圖1 蛇床子總香豆素藥液殺螺效果

圖2 酯酶同工酶圖譜

2.2 酯酶同工酶電泳結(jié)果分析 酯酶同工酶電泳圖譜結(jié)果見圖2.整個圖譜可發(fā)現(xiàn)9條深淺不一的酶帶.隨著處理時間的延長，各個酶帶呈現(xiàn)明顯寬度和顏色的變化，并伴隨酶帶條數(shù)的減少.在處理24h和48h時，酶帶顏色加深，并伴隨新酶帶的出現(xiàn)，表明此時酯酶活性高于對照組；處理時間在72h以后，各酶帶顏色明顯變淺，分別有2條（72h）和4條（96h）酶帶消失.

2.3 釘螺軟體組織干重和糖原結(jié)果與分析 蛇床子總香豆素和處理時間都顯著地影響了釘螺的干重和糖原含量（P＜0.05）.經(jīng)蛇床子總香豆素（濃度為LC50）處理釘螺4d后的釘螺的軟體組織的平均干重、糖原含量發(fā)生明顯變化（表1）.總香豆素和處理時間與釘螺的干重顯著地負(fù)相關(guān)，隨著處理時間的延長，釘螺的干重明顯降低，并在第3、4天都達(dá)到顯著水平（P＜0.05）.釘螺經(jīng)提取物處理后糖原含量的變化如表1所示.表中數(shù)據(jù)表明，經(jīng)蛇床子總香豆素處理1d后，相對于清水對照組數(shù)據(jù)，釘螺軟體的糖原含量開始逐漸下降，減少幅度從7.66%到30.06%，并在第3、4天都達(dá)到顯著水平（P＜0.05）.

表1 釘螺的軟體組織干重和糖原含量

3 討論

由于化學(xué)殺螺劑對環(huán)境的污染，生物源殺螺劑的研究日益受到重視［15］，本研究結(jié)果表明，蛇床子總香豆素確有較強(qiáng)的殺螺作用.10mg／L以上的蛇床子總香豆素藥液處理3d以上時間，具有100%的殺螺效果.作為植物源類藥物，蛇床子總香豆素對周圍環(huán)境污染遠(yuǎn)小于化學(xué)殺螺劑.酯酶作為動物體內(nèi)的一種重要解毒酶系統(tǒng)，參與蛋白質(zhì)代謝、酯類代謝、信號傳導(dǎo)和解毒等多種過程，并廣泛分布于動物各細(xì)胞內(nèi)［16-17］.本研究發(fā)現(xiàn)在蛇床子香豆素處理后，釘螺酯酶活性均表現(xiàn)出先增強(qiáng)，然后逐漸減弱和消失的趨勢.本結(jié)果和其他植物源藥物（百部總堿、夾竹桃強(qiáng)心總甙和羊蹄）的殺螺研究一致［12-13，18］.在藥物處理釘螺的早期，酯酶表達(dá)水平受藥物刺激而增加，釘螺的解毒能力增強(qiáng)；隨處理時間的延長，藥物在釘螺體內(nèi)的濃度升高，當(dāng)超過釘螺耐受濃度的生理閥值后，釘螺酯酶表達(dá)被抑制，最終降低釘螺的解毒能力，致使釘螺死亡［13］.作為釘螺體內(nèi)重要能源貯存形式，糖原在釘螺體內(nèi)廣泛分布，并分解為葡萄糖，提供生理活動所需能量.當(dāng)糖原濃度降低時，釘螺的解毒活性會受到抑制.蛇床子總香豆素能顯著地降低釘螺體內(nèi)的糖原含量，至96h時減少幅度達(dá)30.06%.這與其他植物源藥物的殺螺報道一致［19］.殺螺藥物可能通過破壞釘螺的肝功能，改變糖原代謝過程中的某些酶的活性，抑制消化道攝取葡萄糖能力等方式，導(dǎo)致糖原含量的下降［12］.

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