楊 靜，蔣劍春，張 寧，衛(wèi) 民，趙 劍

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042)

多年來(lái)，傳統(tǒng)能源的大量使用導(dǎo)致了能源危機(jī)以及環(huán)境惡化。為了實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，可再生、無(wú)污染的生物質(zhì)能源已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。其中木質(zhì)纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生能源物質(zhì)，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)全世界每年產(chǎn)量大約為100億t[1]。利用農(nóng)林廢棄物作為原料生產(chǎn)乙醇，實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源的高值化利用，有利于改善生態(tài)環(huán)境，符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的要求，還可以增加農(nóng)民的收入。

橡子是殼斗科麻櫟屬(QuercusacutissimaCarruth)和常綠櫧栲類野生植物橡樹(shù)的果實(shí)。全世界有8屬900余種，分布于溫帶、亞熱帶和熱帶，我國(guó)占6屬301種[2]。我國(guó)有著豐富的橡子資源，橡子林約有1 300～1 670萬(wàn)hm2，每年可產(chǎn)60～70億kg橡子[3]。橡子仁既可作為動(dòng)物飼料、工業(yè)原料，也可用來(lái)加工保健食品，以橡實(shí)淀粉為原料生產(chǎn)生物燃料酒精也是一條較好的利用途徑，成為目前研究的熱點(diǎn)[4]。由此產(chǎn)生的橡子殼產(chǎn)量大、來(lái)源廣、價(jià)格低，但卻無(wú)法得到很好的利用，不僅污染環(huán)境而且造成能源浪費(fèi)。因此，可以考慮利用纖維素酶水解糖化橡子殼，從而充分利用生物質(zhì)資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素構(gòu)成，三者通過(guò)基團(tuán)間的化學(xué)作用力相互結(jié)合在一起的，纖維素被木質(zhì)素與半纖維素包裹在內(nèi)部，從而阻礙了纖維素的水解糖化[5]。因此，欲酶解纖維素必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理。常用的預(yù)處理的方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法和聯(lián)合預(yù)處理法等[6]。其中稀酸預(yù)處理是最常用的方法之一。在原料的各組分中，纖維素對(duì)稀無(wú)機(jī)酸的作用比半纖維素穩(wěn)定，再加上木質(zhì)素處于纖維的外表，對(duì)纖維素起一定的保護(hù)作用，所以用稀無(wú)機(jī)酸處理時(shí)，首先被酸水解的是半纖維素，然后再溶解部分木質(zhì)素。本文作者以林業(yè)廢棄物橡子殼為原料，考察稀酸法預(yù)處理對(duì)其酶水解效果的影響，期望得到低成本、高利用率且易于工業(yè)化的纖維素糖化工藝，為橡實(shí)資源的規(guī)?；_(kāi)發(fā)以及在液體燃料生產(chǎn)中的應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用橡子采自安徽滁州，風(fēng)干后脫殼，將橡子殼50 ℃烘干備用。纖維素酶：無(wú)錫市雪梅酶制劑有限公司(酶活15.6 FPU/g，實(shí)驗(yàn)室測(cè)得)。

1.2 預(yù)處理

取10 g橡子殼浸泡在2%的硫酸溶液中，固液比1 ∶8(g ∶mL)，分別在室溫中靜置48 h以及在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃(0.15 MPa)處理1 h。處理結(jié)束后，用蒸餾水將原料洗至中性，50 ℃烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩得0.30～0.45 mm的顆粒待用。將室溫酸處理樣品標(biāo)記為1#；121 ℃/0.15 MPa酸處理樣品標(biāo)記為2#；未處理樣品標(biāo)記為0#。

1.3 成分分析

按照范式(Van Soest)的洗滌纖維素分析法測(cè)定各樣品的半纖維素，纖維素，木質(zhì)素含量。分別測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)，酸性洗滌纖維(ADF)，和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)。其中ADF與ADL的差值為纖維素含量，NDF與ADF的差值為半纖維素含量，ADL與酸不溶灰分的差值為木質(zhì)素含量；按照GB/T 15686—2008測(cè)定橡子殼單寧含量。并按照(1)式計(jì)算纖維素回收率(yrec,%)[7]。

(1)

式中：Mpret—預(yù)處理后原料干質(zhì)量，g；Mor—未處理原料干質(zhì)量，g；Cpret—預(yù)處理原料纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；Cor—未處理原料纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.4 酶水解

分別稱取2 g的0#、 1#、 2#樣品，加入0.1 mol/L，pH值4.8的檸檬酸緩沖液，固液比為1 ∶20(g ∶mL)，于50 ℃水浴中預(yù)熱20 min，然后按照20 FPU/g(以纖維素計(jì))的酶量加入纖維素酶，于50 ℃， 150 r/min水解 72 h。結(jié)束后，立即用冰塊終止酶水解，過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。按照(2)式計(jì)算酶水解得率(yeeh,%)：

(2)

式中：Mdm—樣品干質(zhì)量，g；Mg—葡萄糖質(zhì)量，g； 0.9為纖維素和葡萄糖之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)；Cpret—樣品中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。并按照(3)式計(jì)算總體葡萄糖產(chǎn)率(yp,%)：

(3)

式中：yrec—纖維素回收率,%；yeeh—酶水解得率，%。

1.5 分析方法

1.5.1 電鏡掃描(SEM) 預(yù)處理前后橡子殼烘干后，采用電子顯微鏡(3400-N, Hitachi,日本)觀察結(jié)構(gòu)變化，放大倍數(shù)為8 000倍。

1.5.2 紅外光譜(ATR-FTIR) 預(yù)處理前后橡子殼烘干后，以KBr壓片，在MAGNA-IR 550紅外光譜儀(尼高力儀器公司，美國(guó))上檢測(cè)樣品得到FT-IR譜圖，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.5.3 X射線衍射 測(cè)試在Swiss ARL X射線衍射儀上完成，Cu靶，Kα射線，工作電壓40 kV，電流30 mA,掃描速度4.0°/min，步長(zhǎng)為0.02°，掃描范圍5.00～40.00°。參考Segal等[8]經(jīng)驗(yàn)法計(jì)算橡子殼中纖維素的相對(duì)結(jié)晶度(Icr)，計(jì)算公式如(4)式：

(4)

式中：I002—(002)面衍射強(qiáng)度；Iam—2θ接近16°時(shí)，非結(jié)晶背景衍射的散射強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

利用稀硫酸，在不同條件下(室溫1#樣品,高溫高壓2#樣品，見(jiàn)2.1節(jié))對(duì)橡子殼進(jìn)行了預(yù)處理，對(duì)預(yù)處理前后的原料進(jìn)行了成分分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 100 g橡子殼預(yù)處理前后主要成分(干基)

橡子殼中含纖維素34.5%，半纖維素20.4%和木質(zhì)素36.6%。其中綜纖維素的含量達(dá)到54.9%，這與高粱桿的組成類似，低于麥草[9-10]和其他硬/軟木[11]。橡子殼中木質(zhì)素的含量較高，遠(yuǎn)高于高粱桿、麥草等木質(zhì)纖維素原料，但是較??pür等[12]和Yeim等[13]報(bào)道的榛子殼含量低，由此可能推測(cè)殼類物質(zhì)含有較高含量的木質(zhì)素。橡子殼纖維素含量居中，高于高粱桿[14]和榛子殼，在文獻(xiàn)報(bào)道的麥草的纖維素含量范圍內(nèi)，可以加以利用。經(jīng)過(guò)預(yù)處理，原料的纖維素回收率(見(jiàn)表2)分別為99.7%(室溫)和75.4%(121 ℃/0.15 MPa)。后者的纖維素?fù)p失率較高(較原料損失24.6%)，這意味著在高溫高壓下有更多的纖維素被降解成葡萄糖以及其它物質(zhì)。原因可能是隨著處理?xiàng)l件的加劇，更多半纖維素被除去，使得纖維素更容易受到酸溶液的破壞。室溫下的半纖維素和木質(zhì)素去除率為21.6%和6.6%；高溫高壓(121 ℃，0.15 MPa)下為84.6%和24.5%，較室溫處理的效果較好。

表2 預(yù)處理對(duì)纖維素回收率和酶水解效果的影響

2.2 酶水解

對(duì)酸處理后的原料進(jìn)行水洗，粉碎，酶水解72 h，測(cè)定酶水解得率yeeh，并計(jì)算總體葡萄糖產(chǎn)率yp，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，酶水解得率均有所增加，兩種條件下的增幅相差不大，從未處理前的42.8%分別提高到71.4%和72.1%，增幅分別為66.8%和68.5%。結(jié)合纖維素回收率，室溫下的總體葡萄糖產(chǎn)率達(dá)到71.2%，提高了66.4%，而高溫高壓下的酶水解得率雖然有所增加，但是由于纖維素?fù)p失率較高，導(dǎo)致總體葡萄糖產(chǎn)率增幅不大，只有54.4%。

2.3 電鏡掃描分析

利用掃描電鏡觀察橡子殼預(yù)處理前后表面形態(tài)的變化，見(jiàn)圖1。從8 000倍電鏡掃描的照片可以看出未處理原料纖維表面平整光滑，結(jié)構(gòu)致密，光滑無(wú)孔，呈現(xiàn)有序的片層狀；經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后可見(jiàn)單根纖維或纖維束表面有部分?jǐn)嗔?，甚至形成較大的凹陷和裂痕，表面出現(xiàn)孔洞，結(jié)構(gòu)變得蓬松。由此可知，稀酸預(yù)處理破壞了橡子殼的纖維結(jié)構(gòu)，這樣纖維素酶分子與底物的接觸位點(diǎn)將大大提高，從而可使酶解后還原糖產(chǎn)率提高。

0#.未處理untreated material; 1#.室溫酸處理pretreatment at room temperature; 2#.121 ℃，0.15 MPa酸處理pretreatment at 121 ℃，0.15 MPa

2.4 紅外光譜分析

在木質(zhì)纖維原料分析中，紅外光譜可用于對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素作定性分析，也可用于定量分析。橡子殼預(yù)處理前后的紅外光譜分析圖見(jiàn)圖2。

2.5 X射線衍射分析

圖3為原料處理前后的橡子殼的X射線衍射圖。由圖3可看出,橡子殼經(jīng)過(guò)處理后,衍射圖的基本形狀沒(méi)有改變,說(shuō)明處理前后原料的晶型結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化。在衍射角2θ為16°以及22.5°處的衍射峰強(qiáng)度都有所升高,說(shuō)明預(yù)處理對(duì)橡子殼的纖維部分處理效果較好，纖維中的無(wú)定形區(qū)及結(jié)晶區(qū)表面經(jīng)硫酸預(yù)處理后大量溶出，而將結(jié)晶區(qū)暴露在外使其吸收強(qiáng)度變大。同時(shí)計(jì)算得原料的結(jié)晶度為35.7%，室溫處理原料為20.1%，高溫高壓下為27.9%。

圖2 橡子殼預(yù)處理前后紅外光譜圖

經(jīng)稀硫酸預(yù)處理后纖維素的結(jié)晶度有所降低，尤其是室溫處理的下降幅度更為明顯，達(dá)到43.7%。這是預(yù)處理后酶水解產(chǎn)率升高的一大因素。經(jīng)過(guò)處理后，分子鏈間的排列變得疏松，纖維素表面積增大，酶對(duì)纖維素的可及度升高，從而使水解產(chǎn)率增加。而研究表明，稀酸預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度的影響具有雙重效應(yīng)，其一是稀酸處理后將無(wú)定形區(qū)的木質(zhì)素和半纖維素組分除去，提高了木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度；其二是稀酸處理能通過(guò)潤(rùn)脹作用解開(kāi)一些高度結(jié)合在一起的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使結(jié)晶度下降。因而，稀酸處理過(guò)程中木質(zhì)纖維素結(jié)晶度的變化依賴于這兩重效應(yīng)的作用強(qiáng)弱[16]。

3 結(jié) 論

以橡子殼作為原料，通過(guò)化學(xué)分析方法、SEM、X射線衍射分析、紅外光譜分析等分析方法，考察了稀硫酸預(yù)處理對(duì)其結(jié)構(gòu)成分以及酶水解效率的影響。利用2%硫酸溶液分別在室溫預(yù)處理48 h以及在高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃(0.15 MPa)預(yù)處理1 h。隨后加入20 FPU/g纖維素的纖維素酶，于50 ℃，150 r/min水解72 h。結(jié)果表明：

3.1 橡子殼中含有36.6%的木質(zhì)素，含量較高，不利于酶水解。室溫酸處理樣品的半纖維素和木質(zhì)素去除率分別為21.6%和6.6%。酶水解得率為71.4%，總體葡萄糖產(chǎn)率達(dá)到71.2%，提高了66.4%。

3.2 121 ℃， 0.15 MPa下酸處理樣品的半纖維素和木質(zhì)素的去除率分別為84.6%和24.5%。酶水解得率為72.1%，較處理前提高了68.5%，但是由于纖維素?fù)p失率較高，導(dǎo)致總體葡萄糖產(chǎn)率增幅不大，只有54.4%。

3.2 經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，物料的纖維束結(jié)構(gòu)變得松散、纖維比表面積增大、表面孔洞增加；纖維結(jié)構(gòu)的無(wú)定型區(qū)比例升高、結(jié)晶度下降；原料半纖維素和部分木質(zhì)素被降解，有利于增加纖維素酶的可及度，從而提高纖維素酶水解效率。

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