冒曉蓓，劉小北，徐 凱，褚曉源，郁紅菊，薛利軍，陳亞楠，任麗麗，戴婷婷，陳龍邦

0 引 言

近年來結(jié)腸癌在我國呈現(xiàn)高發(fā)病趨勢，是全球三大最常見的癌癥之一［1］。目前采用手術(shù)和放化療都可使結(jié)腸癌病情得到顯著改善，但晚期結(jié)腸癌患者預后仍然較差，尤其是肝轉(zhuǎn)移極易發(fā)生［2］。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(Forkhead box M1，F(xiàn)oxM1)是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，在維持細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用［3］。FoxM1基因表達激活使細胞分化受到抑制，從而導致了分化不良細胞的惡性轉(zhuǎn)變［4］。多個研究發(fā)現(xiàn)FoxM1基因在肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中高度表達，且其表達水平與腫瘤的分級、分期和預后有著顯著性的相關(guān)性［5－8］。初步研究顯示，F(xiàn)oxM1在腸癌中異常高表達［9］，對腫瘤的生長、侵襲以及血管的生成能力均有著重要的影響。前期研究顯示FoxM1參與了大鼠結(jié)腸癌的發(fā)生和增殖［10］。為了解結(jié)腸癌細胞基因調(diào)控的分子機制，我們進一步探討了FoxM1對人結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為開發(fā)新的結(jié)腸癌靶向治療方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 腸癌細胞系HT-29、HCT-116均為本課題組保存。其中HT-29細胞培養(yǎng)采用RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)、HCT-116細胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)，均添加10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)及1%雙抗(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司)，在含5%的CO2的37℃培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細胞均為貼壁生長，每隔2天更換培養(yǎng)液1次，根據(jù)細胞生長狀況按1∶2～1∶4傳代，消化細胞所用2.5%胰酶購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，待細胞融合至70%～80%，可進行后續(xù)試驗。

1.2 FoxM1的超表達載體及siRNA干擾載體的構(gòu)建 對FoxM1基因設(shè)計3條siRNA干擾序列:5'-GCUGGGAUCAAGAUUAUUATT-3'、5'-GUGGGCCCAACAAAUUCAUTT-3'、5'-GGCUGCACUAUCAACAAUATT-3'，應用RT-PCR及Westen bolt方法檢測 HT-29細胞株中FoxM1的干擾效率，篩選出抑制效果最佳的序列:5'-GGCUGCACUAUCAACAAUATT-3'。相應的干擾質(zhì)粒載體pGPH-shFoxM1及相應的空載體質(zhì)粒對照(pGPH-shNC)，過表達FoxM1基因的質(zhì)粒載體(pEX-2-FoxM1)及相應的空載質(zhì)粒(pEX-2-NC)，均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染體系建立及實驗分組 HT-29和HCT-116細胞株轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine 2000產(chǎn)品說明書進行。轉(zhuǎn)染前1d將細胞分別以1×105個/孔、5×104個/孔的密度接種于24孔板中，使轉(zhuǎn)染前細胞融合率達到60%～70%。轉(zhuǎn)染時設(shè)定脂質(zhì)體的濃度分別為 0.5、1、1.5 μL，并將其稀釋于RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基50μL，pGPH-shFoxM1及其陰性對照pGPH-shNC 的濃度分別為:0.5、1、2、4μg，稀釋后脂質(zhì)體靜置5 min，與同樣用培養(yǎng)基50 μL稀釋的質(zhì)?；旌?，靜置20 min，分別加入24孔板中。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48～72 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。HCT-116、HT-29 2種細胞株均分為3組，具體如下述:①空白對照組(不轉(zhuǎn)染組);②實驗對照組:轉(zhuǎn)染相應空載質(zhì)粒(pGPH-shNC及pEX-2-NC);③實驗組:轉(zhuǎn)染FoxM1干擾質(zhì)粒及FoxM1過表達質(zhì)粒。

1.4 熒光實時定量(real time PCR，RT-PCR)法檢測FoxM1基因表達水平 取各組轉(zhuǎn)染后24 h細胞，采用Trizol提取總RNA，經(jīng)Dnase酶消化基因組DNA后，采用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-Script1st Strand cDNA Synthesis Kit)進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，方法參照試劑盒說明書。同時采用TAKARA公司的定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)進行RT-PCR檢測，反應體系參考試劑盒說明書。PCR反應條件為95℃，10s;60℃，10s;72℃，10s;共40個循環(huán)。讀取CT值，采用△△CT法進行數(shù)據(jù)分析。

FoxM1的定量引物為:正義鏈:5'-AACCGCTACTTGACATTGG-3'，反義鏈:5'-GCAGTGGCTTCATCTTCC-3'。GAPDH的定量引物為:正義鏈:5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3'，反義鏈:5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。

1.5 Western blot方法檢測FoxM1蛋白表達水平提取轉(zhuǎn)染72 h后各組細胞的總蛋白，并進行蛋白定量，按《分子克隆實驗指南》［11］所述方法配制SDSPAGE分離膠(12%)和濃縮膠(5%)，待膠凝固后每孔上樣30 μg蛋白，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、顯像。利用圖像分析儀對膠片顯像條帶進行灰度分析，以內(nèi)參照β-actin進行校正。

1.6 劃痕愈合試驗 取對數(shù)生長期穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞，細胞接種于包被CollagenⅣ的6孔板，置37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜后回收CollagenⅣ，再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中干燥過夜，培養(yǎng)至細胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長狀態(tài)。分別在各組單細胞層上劃痕，用含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0、12、24、48h每個孔取4個視野拍照，在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。

愈合率(%)=(0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%

1.7 Transwell侵襲試驗 取對數(shù)生長期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，用無血清RPMll640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室和matrigel膠檢測細胞侵襲性。結(jié)果表示為穿過matrigel膠和聚碳酸酯膜的細胞數(shù)，顯微鏡下每個復孔取5個高倍鏡視野計數(shù)(×400)，計算平均值。1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間均值比較采用t檢驗，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2株人腸癌細胞系的 FoxM1表達分析RT-PCR及Western blot檢測均顯示，F(xiàn)oxM1在HT-29細胞中表達水平較HCT-116高。見圖1。

圖1 HCT-116及HT-29細胞株中mRNA及蛋白表達比較Figure1 Expression of FoxM1 mRNA and protein in HCT-116 and HT-29 cell lines

2.2 HT-29和HCT-116轉(zhuǎn)染體系的建立 采用pGPH-shNC(FAM)空載體轉(zhuǎn)染HT-29和HCT-116細胞48 h后檢測熒光信號，根據(jù)熒光強度檢測轉(zhuǎn)染效率，從而建立高效的HT-29和HCT-116轉(zhuǎn)染體系。結(jié)果表明，脂質(zhì)體為 1 μL/孔 ，pGPH-shNC(FAM)濃度2 μg/孔時，共培養(yǎng)48 h為最佳的轉(zhuǎn)染條件。見圖2。

圖2 pGPH-shNC(FAM)載體轉(zhuǎn)染HT-29細胞48 h后熒光信號表達Figure2 Fluoresecent signals in HT29 cells transfected by pGPH-shNC(FAM)vector post 48 hours

2.3 FoxM1基因?qū)T-29和HCT-116侵襲性的影響 為研究FoxM1的表達對人結(jié)腸癌細胞的調(diào)控，本研究基于優(yōu)化的HT-29和HCT-116轉(zhuǎn)染體系，應用RNA干擾技術(shù)有效下調(diào)FoxM1在HT-29細胞中的表達，同時采用過表達質(zhì)粒調(diào)高HCT-116中FoxM1表達水平，24h后提取RNA，72 h后提取蛋白。RT-PCR檢測結(jié)果表明HCT-116細胞株中過表達FoxM1后其mRNA的表達水平顯著上調(diào)，采用pGPH-shFoxM1轉(zhuǎn)染HT-29細胞后，F(xiàn)oxM1表達水平顯著下調(diào)。Western blot結(jié)果亦表明，F(xiàn)oxM1蛋白在HT-29中成功下調(diào)，在HCT-116中成功上調(diào)。見圖3。

圖3 FoxM1在HCT-116及HT-29細胞轉(zhuǎn)染pGPH-shFoxM1和pEX-2-FoxM1的表達變化Figure3 FoxM1 expression in HCT-116 and HT29 cell lines transfected by pGPH-shFoxM1 and pEX-2-FoxM

2.3.1 劃痕愈合實驗 轉(zhuǎn)染 pGPH-shFoxM1 48 h后，HT-29的增殖能力明顯受到抑制，愈合率僅為(10.37±3.86)%，與 HT-29實驗對照組(42.0±2.0)% 及 HT-29空 白 對 照 組(37.0±2.2)%相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而在HCT-116細胞中上調(diào)表達FOXM1后，愈合率提高至(70.92±1.48)%，表示增殖力明顯得到了提高，與HCT-116實驗對照組［(18.43±3.01)%］及 HCT-116空白對照組［(67.36±2.61)%］相比差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見圖4。

2.3.2 Tanswell小室檢測細胞侵襲能力 HT-29和 HCT-116腸癌細胞接種在 Matrigel膠鋪被的 transwell小室中48 h之后，HCT-116實驗組平均穿膜細胞數(shù)［(186.0±6.8)個］較HCT-116實驗對照組［(42.0±2.0)個］和HCT-116空白對照組［(37.0±2.2)個］升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HT-29實驗組平均穿膜細胞數(shù)［(53.0±1.8)個］較 HT-29空白對照組［(118.0±4.0)個］和 HT-29實驗對照組［(95.0±2.2)個］降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見圖5。

圖5 FoxM1對HCT-116及HT-29細胞侵襲的影響Figure5 The effect of FoxM1 on the invasion of HCT-116 and HT-29

圖4 FoxM1對HCT-116及HT29細胞遷移的影響Figure4 The effect of FoxM1 on the migration of HCT-116 and HT29

3 討 論

FoxM1參與細胞增殖、凋亡以及人體多種器官發(fā)育［4］。FoxM1僅表達于高增殖狀態(tài)的細胞中，如所有胚胎組織，特別是上皮和間質(zhì)的增殖細胞中;在人體組織中，F(xiàn)oxM1僅高度表達于胸腺和睪丸組織，中度表達于肺和腸道［12］。惡性腫瘤的發(fā)生正是由于在致癌因素作用下，遺傳物質(zhì)發(fā)生改變導致細胞增殖信號過度活化。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1常高表達于肝癌［13］、前列腺癌［14］、胃癌［15］等多種惡性腫瘤中，同時，它與多種癌基因信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)［16］，包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路、細胞外信號激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路、蛋白酶體通路等。特異性FoxM1抑制劑在腫瘤治療方面的研究提示FoxM1極有希望成為一個新的抗癌靶點［17］。

在肝細胞癌(hepatic celluler cancer，HCC)中，F(xiàn)oxM1是ERK的主要效應器。FoxM1b在HCC小鼠模型及HCC細胞系中，均有高表達。其表達增高與ERK正相關(guān)，可促進HCC的腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞凋亡。相反，抑制FoxM1b表達，可下調(diào)ERK激活水平，減少HCC細胞株的血管形成，促進細胞凋亡［18］。FoxM1c可增強細胞增殖的關(guān)鍵因子cyclin E/Cdk2的表達，后者被認為是c-myc基因的反式激活啟動子［4］。有學者在胃癌細胞株研究中發(fā)現(xiàn)，c-myc是FoxM1調(diào)控的下游基因［15］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1和NF-κB在細胞分化、細胞周期、細胞增殖、細胞死亡、細胞遷移等生物學行為中發(fā)揮重要作用［19－20］，但兩者之間的相互作用機制仍需進一步闡明。Ma等［21］發(fā)現(xiàn)，Raf/MEK/MAPK的激活對于FoxM1核轉(zhuǎn)移不可或缺，同時，可促進FoxM1與cyclin B1之間交互作用，繼而促進細胞的有絲分裂。應用Raf/MEK/MAPK抑制劑U0126后，F(xiàn)oxM1表達顯著受抑，并使細胞停滯于G2/M期。綜上所述，F(xiàn)oxM1表達失調(diào)與多種細胞增殖、凋亡等進程相關(guān)細胞因子及信號轉(zhuǎn)導通路均相關(guān)，已成為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的新熱點分子。

本研究在細胞水平探索了FoxM1表達水平變化對結(jié)腸癌細胞的體外運動和侵襲性。首先針對FoxM1基因設(shè)計了3條不同的 siRNA干涉序列，優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染條件后應用不同的siRNA對細胞進行轉(zhuǎn)染，最終選定抑制效果最強的FoxM1 siRNA。繼而根據(jù)該序列合成干擾表達質(zhì)粒pGPH-shFoxM1。應用 RT-PCR及 Western blot檢測，提示FoxM1在HT-29細胞中高表達，而在HCT-116細胞中呈低表達。進一步在細胞水平探索了FoxM1表達對結(jié)腸癌細胞的體外運動和侵襲性的影響。采用RNA干擾的方法下調(diào)結(jié)腸癌細胞HT-29中FoxM1表達水平并采用過表達質(zhì)粒調(diào)高HCT-116中FoxM1表達，利用劃痕實驗和細胞侵襲實驗探討FoxM1對結(jié)腸癌細胞生長和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示RNA干擾可使FoxM1表達下調(diào)，下調(diào)FoxM1表達可抑制細胞的遷移能力和侵襲性。反之，過表達質(zhì)?？捎行д{(diào)高FoxM1表達水平，上調(diào)FoxM1表達可提高細胞的遷移能力和侵襲性。本研究與Kalinichenko等［6］研究結(jié)果相似，抑制FoxM1表達可顯著抑制肝癌等多種細胞的遷移能力和增殖性。這些結(jié)果均為尋找新的治療靶點提供了有力的依據(jù)。總之，F(xiàn)oxM1對結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲能力具有重要的影響，具有發(fā)展成新型結(jié)腸癌治療靶位的潛力。

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