龐榮清，李自安，阮光萍，何潔，王強(qiáng)，王金祥，潘興華，張成，張永云，4，張小飛

(1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；

3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州 510080；

4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，昆明 650201；

5.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102600)

Duchenne型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是致死性X連鎖隱性遺傳病。目前尚無有效治療方法[1]。建立遺傳特征與臨床癥狀與DMD患者相似的動(dòng)物模型是探索DMD治療的關(guān)鍵。Dystrophin和utrophin雙敲出(double-knockout，DKO)小鼠是DMD研究常用的動(dòng)物模型，為開展DMD治療，尤其是干細(xì)胞治療提供了重要條件[2]。我們課題組從英國牛津大學(xué)引進(jìn)了雜合子種鼠，本文以此為研究對(duì)象，探討DKO小鼠的飼養(yǎng)管理、鑒定方法以及干細(xì)胞移植重建dystrophin表達(dá)的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑器材

DMD模型種鼠由英國牛津大學(xué)Davies教授惠贈(zèng)(動(dòng)物入境檢疫許可證號(hào)為AD44010011)，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(滇)2013-0011】。陽性對(duì)照鼠為C57BL/6。DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25% trypsin-EDTA均為Gibco公司生產(chǎn)；一抗mouse-anti-human dystrophin和二抗FITC-goat-anti-mouse IgG均為Santa Cruz公司生產(chǎn)；倒置相差顯微鏡、生物顯微鏡和熒光顯微鏡為Nikon公司生產(chǎn)。

1.2 基因型鑒定

種鼠交配后獲得的子代鼠用于基因型鑒定。將子代小鼠固定，酒精擦拭尾巴，剪斷尾尖少許，取自然滴下的血液50～100 μL至事先加入100 μL抗凝劑的Eppendorf管，置于低溫條件下送實(shí)驗(yàn)室按照微量血液DNA提取試劑盒說明書的要求提取基因組DNA。按本課題組建立的實(shí)驗(yàn)方法序列特異性引物(sequence specific primers，SSP)-PCR法進(jìn)行基因型鑒定[3]。上游引物：5’-GTG AAG GAT GTC ATG AAA G-3’，下游引物1：5’-TGA AGT CCG AAA GAG ATA CC-3’，下游引物2：5’-ACG AGA CTA GTG AGA CGT GC-3’。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段，溴化乙啶染色后紫外燈下觀察照相。

1.3 外形觀察

由專業(yè)飼養(yǎng)員精心飼養(yǎng)觀察經(jīng)基因型鑒定確定的DKO小鼠，注意比較觀察DKO小鼠與C57小鼠精神狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能。

1.4 肌酸激酶測定

采集16周齡DKO小鼠外周血血漿，采用生化分析儀測定外周血CK含量。

1.5 組織病理學(xué)檢測

參照本課題組建立的技術(shù)方法[3]，取16周齡C57鼠和DKO鼠后肢肌肉，制作病理切片，行HE染色，生物顯微鏡下觀察病理結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 hUCMSC的準(zhǔn)備及移植

按照本課題組建立的方法[4]分離擴(kuò)增hUCMSC，即采集臍帶，無菌條件下剪碎并轉(zhuǎn)移至含10%血清的DMDM/F12中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長增殖情況，當(dāng)細(xì)胞生長至90%融合時(shí)胰酶消化傳代培養(yǎng)，第三代hUCMSC用于移植實(shí)驗(yàn)研究。收集生長良好的第三代細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，采用股直肌肌肉注射的方式每只鼠移植0.5 mL的hUCMSC，對(duì)照組注射無細(xì)胞的等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

1.7 人dystrophin的檢測

參照我們課題組建立的技術(shù)方法[3]，取移植細(xì)胞的DKO鼠后肢肌肉，制作冰凍切片，室溫條件下用10%正常羊血清作用1h，加入一抗mouse anti-human dystrophin于4℃孵育過夜，PBS漂洗后加入二抗FITC-goat anti-mouse IgG于室溫孵育1h，PBS漂洗后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 DKO小鼠的鑒定

采用SSP-PCR方法可以將DMD模型小鼠鑒定為mdx、雜合子和DKO三種基因型，即如果只擴(kuò)增出340 bp一個(gè)條帶的，提示有正常的utrophin基因，為mdx小鼠；如果只擴(kuò)增出285 bp一個(gè)條帶的，提示其utrophin基因異常，為DKO小鼠；如果同時(shí)擴(kuò)增出340 bp和285 bp兩個(gè)條帶的，提示其有1個(gè)正常的utrophin基因，而另外一個(gè)等位基因異常，為utrophin基因雜合子mdx小鼠(見圖12)。本實(shí)驗(yàn)前后共鑒定子代鼠85只，結(jié)果mdx小鼠22只，雜合子小鼠45只，DKO小鼠18只，按百分比計(jì)算，分別占25.9%、52.9%、21.2%，符合孟德爾遺傳規(guī)律。

注：1.mdx小鼠(340 bp); 2.DKO小鼠(285 bp); 3.雜合子小鼠(285 bp+340 bp); 4.用純水代替DNA模板的空白對(duì)照。

2.2 dko小鼠的飼養(yǎng)觀察

隨著DKO小鼠的生長，肌營養(yǎng)不良的癥狀逐漸突顯，表現(xiàn)為生長遲緩、皮毛稀疏無光澤，活動(dòng)力逐漸減弱，后期出現(xiàn)明顯的后肢癱瘓(見圖2，彩插11)，總體而言，DKO小鼠9周齡即可出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能減退，12周即可肌萎縮，生存期約20周。DKO小鼠外周血CK值顯著高于對(duì)照的C57鼠，而C57小鼠皮毛密集黝黑有光澤，好動(dòng)活力好。飼養(yǎng)管理員需要及時(shí)補(bǔ)充高蛋白飼料，否則臨床癥狀更加明顯。

2.3 血漿肌酸激酶變化

16周齡DKO小鼠外周血血漿肌酸激酶含量高達(dá)16988.52±617.48 IU/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C57小鼠的含量。

2.4 組織學(xué)變化

HE染色顯示：正常對(duì)照C57小鼠肌纖維細(xì)胞大小均一，細(xì)胞核位于肌細(xì)胞邊緣，肌間隙均一正常，無炎性細(xì)胞浸潤，而DKO小鼠肌纖維細(xì)胞大小不一，多見核中移細(xì)胞，肌間隙明顯增寬，常見脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織增生，可見炎性細(xì)胞浸潤或肌細(xì)胞壞死(見圖3，彩插11)。

2.5 hUCMSC分離

采用剪碎臍帶為糊狀直接加入含10% FBS的DMEM/F12貼壁培養(yǎng)的方法，可以在光鏡下觀察到少數(shù)長梭形貼壁生長的細(xì)胞或從小組織塊周圍長出少許貼壁生長的細(xì)胞，這些細(xì)胞散在分布或圍繞組織塊呈克隆狀生長。傳代后大量細(xì)胞均勻分布生長至大部分融合狀態(tài)時(shí)，可見大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞呈漩渦狀生長，呈現(xiàn)明顯的方向性，顯示間充質(zhì)干細(xì)胞的典型形態(tài)特征(圖4，彩插11)。

2.6 重建dystrophin表達(dá)的檢測

本研究直接注射hUCMSC至DKO小鼠后肢股直肌，兩個(gè)月后采用免疫熒光染色方法檢測到了人dystrophin的表達(dá)，而沒有注射細(xì)胞的對(duì)照小鼠只觀察到極其微弱的熒光背景，檢測不到dystrophin的表達(dá)(見圖5，彩插11)，表明植入的hUCMSC可以在DKO小鼠體內(nèi)再生為肌纖維，證明DKO小鼠是DMD治療良好的動(dòng)物模型。

3 討論

本研究中的雜合子種鼠是將一個(gè)PGKneopA結(jié)構(gòu)[磷酸甘油激酶-1(phosphoglycerate-kinase-1，PGK)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素(neomycin)抗性結(jié)構(gòu)]插入傳統(tǒng)DMD動(dòng)物模型mdx小鼠utrophin一個(gè)等位基因的7號(hào)外顯子內(nèi)，造成該基因功能缺失，從而構(gòu)建成utrophin基因雜合子mdx小鼠，該種鼠互相交配可以產(chǎn)生mdx、DKO和雜合子三種基因型的子代鼠[2]。因此，保存好雜合子種鼠就可以獲得mdx和DKO兩種DMD動(dòng)物模型。本研究結(jié)果顯示：采用SSP-PCR方法可以將雜合子種鼠的子代鼠鑒定為mdx、雜合子和DKO三種基因型，其比例符合孟德爾遺傳規(guī)律，證明該鑒定方法科學(xué)可靠。在隨后的飼養(yǎng)過程中，我們觀察到DKO小鼠生長明顯緩慢，隨著時(shí)間推移肌營養(yǎng)不良的癥狀逐漸突顯，這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]，臨床癥狀非常接近DMD患者。生化檢測結(jié)果顯示：外周血CK值大幅升高，病理組織學(xué)檢查顯示核中移明顯、肌纖維變形或壞死明顯，這些結(jié)果證實(shí)小鼠存在顯著的肌源性損害特征。

研究已經(jīng)證實(shí)：DMD的發(fā)病原因是由于位于X染色體上的dystrophin基因突變或缺失，導(dǎo)致dystrophin蛋白不能表達(dá)。Dystrophin蛋白位于肌細(xì)胞膜上，與肌纖維膜糖蛋白結(jié)合為抗肌萎縮蛋白復(fù)合體(dystrophin-associated protein complex, DAP)，這些蛋白與肌細(xì)胞的粘附蛋白(laminin)聯(lián)結(jié)，共同構(gòu)成細(xì)胞支架，共同維持著肌纖維的穩(wěn)定[5]。DMD患者由于dystrophin蛋白缺失造成細(xì)胞骨架不穩(wěn)定，不能有效抵抗肌纖維的舒縮牽拉，其結(jié)果是細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，肌纖維斷裂、變性或壞死。為了補(bǔ)充變性壞死的肌纖維，處于靜息狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞開始分裂增殖并分化為新的肌纖維，由于患者始終缺乏dystrophin基因，新的肌纖維很快又變性壞死，如此惡性循環(huán)的結(jié)果是耗竭了肌衛(wèi)星細(xì)胞而進(jìn)入失代償狀態(tài)。本研究中觀察到的dko小鼠臨床癥狀的改變，就是由于dystrophin和utrophin功能缺失導(dǎo)致肌纖維穩(wěn)定性破壞的結(jié)果。從這個(gè)意義上來說，DKO小鼠飼養(yǎng)過程中補(bǔ)充高蛋白飼料，有助于新的肌細(xì)胞的再生，有助于緩解臨床癥狀的快速惡化。

干細(xì)胞移植治療DMD的原理就是通過輸入健康供體來源的干細(xì)胞到DMD體內(nèi)以重建dystrophin蛋白的表達(dá)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源充足、活性好、又相對(duì)比較安全、相對(duì)容易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的種子細(xì)胞，已成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)對(duì)象。采用我們先前建立的粘附培養(yǎng)hUCMSC的方法，可以在短期內(nèi)獲得足夠數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞[4]。間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)MHC-II和CD40和CD80等共刺激分子[6，7]，可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)[8]，這些特殊的生物學(xué)特性決定了間充質(zhì)干細(xì)胞可以異體移植或異種移植。本研究中直接注射hUCMSC至DKO小鼠股直肌兩個(gè)月后可以清晰地檢測到人dystrophin的表達(dá)，與最新研究報(bào)道一致[9]。由于DKO小鼠同時(shí)缺乏dystrophin和utrophin的表達(dá)，沒有兩種基因表達(dá)的代償機(jī)制，使得DKO小鼠的肌纖維穩(wěn)定性很差，臨床癥狀與DMD患者相似，用于干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)，一方面容易檢測到dystrophin表達(dá)的變化，另一方面容易觀察到運(yùn)動(dòng)功能的改變，實(shí)驗(yàn)的靈敏度較高，從這個(gè)意義上來說DKO小鼠是開展干細(xì)胞治療DMD研究的理想動(dòng)物模型。DKO小鼠用于干細(xì)胞移植研究的不足之處在于體型較小，限制靜脈輸注細(xì)胞數(shù)量，采集外周血也相對(duì)困難，但雜合子種鼠的飼養(yǎng)不是很難，保種容易，只需采用本研究建立的基因型鑒定方法就可準(zhǔn)確確定DKO小鼠，作為一種珍貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型仍然值得推廣使用。

(本文圖2～5見彩插11。)

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