于淑珍，馮沖，石寧寧，宋小鳳，潘登科

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安 625014)

目前，糖尿病已成為威脅全人類健康的重要疾病之一。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新統(tǒng)計(jì)，2013年全球糖尿病的成人患病率為8.3%，高達(dá)3.82億，其中我國(guó)患病人數(shù)為9840萬(wàn)，居全球首位[1]。在對(duì)糖尿病的發(fā)病機(jī)理和發(fā)展規(guī)律的研究中，基因修飾的動(dòng)物模型已成為一種重要的手段和工具[2,3]。

基因修飾的小鼠模型對(duì)糖尿病的病理生理學(xué)研究做出了很大的貢獻(xiàn)，其中最重要的技術(shù)是外源基因在胰島β細(xì)胞中的特異性表達(dá)。大鼠[4, 5]、小鼠[5]以及人類[7, 8]的胰島素啟動(dòng)子已用于介導(dǎo)致癌基因、報(bào)告基因及CRE重組酶[9, 10]等在轉(zhuǎn)基因小鼠胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大鼠胰島素啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因除了在胰島β細(xì)胞表達(dá)，在大腦中特定的區(qū)域也檢測(cè)到了表達(dá)[9, 11]。小鼠模型在胰島β細(xì)胞病理生理學(xué)基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要作用，而豬和人類的解剖結(jié)構(gòu)、消化代謝、飲食習(xí)慣及基因結(jié)構(gòu)等方面具有更大的的相似性，使其比小鼠在糖尿病治療研究中具有更重要的作用。由于啟動(dòng)子的活性受到其調(diào)控元件和因子間相互作用的影響，在制備轉(zhuǎn)基因豬的過(guò)程中，鑒于豬體內(nèi)的調(diào)控因子可能對(duì)異源啟動(dòng)子的調(diào)控存在差異，選擇其直系同源的豬胰島素啟動(dòng)子將會(huì)比人類和小鼠的啟動(dòng)子發(fā)揮更好的調(diào)控作用。

豬完整的前胰島素原cDNA及其5′側(cè)翼區(qū)序列已被準(zhǔn)確地克隆和研究。豬的胰島素基因有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，在其5′側(cè)翼序列區(qū)含有高度保守的順式作用元件，包括多個(gè)E結(jié)合區(qū)、A結(jié)合區(qū)以及cAMP反應(yīng)結(jié)合元件 (CRE)。本研究利用1.5kb的豬胰島素啟動(dòng)子(包括第一外顯子和第一內(nèi)含子)，針對(duì)是否插入酶切位點(diǎn)及其插入位置不同，構(gòu)建了三種胰島特異性表達(dá)載體，比較分析后獲得了最高效穩(wěn)定的胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)載體，為制備胰島特異性表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因豬奠定了基礎(chǔ)，對(duì)獲得糖尿病動(dòng)物模型以及糖尿病研究治療具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒

小鼠胰島素瘤β細(xì)胞株MIN-6細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室母義明教授惠贈(zèng)；五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞及腎細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室建立；Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、pEASY-T1 Simple Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒載體pcDNA3.1/Hygro和pBluescriptⅡSK(-)來(lái)自Invitrogen公司(美國(guó))；質(zhì)粒載體pIRES-EGFP來(lái)自Clontech公司(美國(guó))。

1.2 試驗(yàn)試劑及材料

限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs，美國(guó))；質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))；LA Taq酶、T4 DNA Ligase(TaKaRa，日本)； 抗GFP標(biāo)簽兔多克隆抗體(ComWin Biotech，北京)；抗β-actin抗體(Abcam，英國(guó))；轉(zhuǎn)染儀AmaxaNucleofectorⅡ及轉(zhuǎn)染試劑盒(Lonza，瑞士 )；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材(BD Falcon，美國(guó))。

1.3 胰島特異性表達(dá)載體的構(gòu)建

參考GenBank中豬胰島素基因序列(登錄號(hào)：AY-242105.1)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增豬胰島素啟動(dòng)子(porcine insulin promoter，PIP)；參考載體pcDNA3.1/Hygro的牛生長(zhǎng)激素PolyA (bovine growth hormone polyadenylation signal, bGHpA) 以及潮霉素抗性基因(hygromycin，Hyg)序列信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (enhanced green fluorescent protein，EGFP)的序列從載體pIRES-EGFP中擴(kuò)增得到。以上使用的4對(duì)引物都使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由中美泰和公司合成。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pEASY-T1 Simple載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1菌株，經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定為陽(yáng)性的菌液送中美泰和公司測(cè)序。為了后續(xù)改造與分析載體，將測(cè)序鑒定后的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶雙酶切后回收目的片段，將回收的酶切產(chǎn)物bGHpA、EGFP、PIP和Hyg依次連入骨架載體pBluescript II SK(-)，構(gòu)建了表達(dá)載體PIP-HindⅢ-EGFP，該載體中HindIII酶切位點(diǎn)在EGFP的起始密碼子ATG前。載體經(jīng)過(guò)PCR和酶切鑒定正確后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，載體信息詳見(jiàn)圖1(A)。

以表達(dá)載體PIP-HindⅢ-EGFP為對(duì)照載體，針對(duì)HindⅢ酶切位點(diǎn)的位置，對(duì)載體進(jìn)行優(yōu)化，改造構(gòu)建了另外兩種載體。一種為：把第一內(nèi)含子3′端的內(nèi)含子剪接受體位點(diǎn)(SA)核酸序列GGTCCT突變?yōu)镠indIII內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)載體PIP-SA(M)-EGFP；另一種為：直接刪除HindIII識(shí)別位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)PIP和EGFP無(wú)縫連接，構(gòu)建表達(dá)載體PIP-EGFP。載體由于酶切位點(diǎn)位置不同導(dǎo)致的序列差異見(jiàn)表1。

注：A.表達(dá)載體主要由豬胰島素基因5′UTR的1500bp序列(豬胰島素啟動(dòng)子，PIP，包含第一外顯子和第一內(nèi)含子)和牛生長(zhǎng)激素3′UTR及其Poly A序列組成。B. PIP啟動(dòng)子翻譯起始位點(diǎn)ATG上游的少部分序列，灰色陰影分別表示第一外顯子和第二外顯子。

表1 三種載體的HindIII酶切位點(diǎn)

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞和豬腎細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清，3.7 g/L碳酸氫鈉、66 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、3.57 g/L HEPES)，在37℃，5% CO2中培養(yǎng)至細(xì)胞≥80%融合時(shí)消化，進(jìn)行傳代、凍存或?qū)嶒?yàn)。

小鼠胰島素瘤β細(xì)胞株MIN-6細(xì)胞在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，高糖DMEM培養(yǎng)基中(需添加64 μmol /L β-巰基乙醇)培養(yǎng)至細(xì)胞≥80%融合時(shí)消化，進(jìn)行傳代、凍存或?qū)嶒?yàn)[12]。

1.5 載體的體外轉(zhuǎn)染驗(yàn)證及表達(dá)檢測(cè)

載體使用無(wú)內(nèi)毒素大提試劑盒提取后，分別轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細(xì)胞，五指山小型豬耳成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞。用轉(zhuǎn)染試劑重懸細(xì)胞，加入8 μg的表達(dá)載體進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞EGFP的熒光，隨后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行細(xì)胞裂解PCR，半定量RT-PCR，β細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞流式分析及Western blot 檢測(cè)，且載體轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆后測(cè)序分析。

體外PCR檢測(cè)試驗(yàn)中共使用3對(duì)引物。PIP-F/R(引物位置見(jiàn)圖1)分別設(shè)計(jì)在豬胰島素啟動(dòng)子的3′端和5′端，用于檢測(cè)cDNA模板中是否有基因組DNA污染，產(chǎn)物大小為1.5 kb；PE-F/R(引物位置見(jiàn)圖1)引物跨PIP的第一內(nèi)含子設(shè)計(jì)，PE-F在豬胰島素啟動(dòng)子PIP第一外顯子序列上，PE-R設(shè)計(jì)在EGFP序列上，用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)；β-actin為管家基因，產(chǎn)物長(zhǎng)188 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的活性及特異性分析

三種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞2 d后，在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察發(fā)現(xiàn)：MIN-6胰島β細(xì)胞均可見(jiàn)明顯的綠色熒光，豬耳成纖維細(xì)胞及腎細(xì)胞中未觀察到綠色熒光。表達(dá)載體PIP-SA(M)-EGFP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光見(jiàn)圖2(彩插5)。裂解細(xì)胞進(jìn)行DNA檢測(cè)，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明質(zhì)粒均整合到了三種細(xì)胞中，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中使用的胰島素啟動(dòng)子可以成功地調(diào)控下游基因在胰島β細(xì)胞中特異性表達(dá)。

2.2 RT-PCR 檢測(cè)及測(cè)序分析

三種載體轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)顯示，PIP-F/R沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，表明反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中不存在基因組DNA污染；對(duì)照載體PIP-HindIII-EGFP和改造載體PIP-EGFP引物PE-F/R的產(chǎn)物存在2條擴(kuò)增條帶872 bp和711bp，而載體PIP-SA(M)-EGFP只有一條872 bp的條帶(見(jiàn)圖3)。將RT-PCR產(chǎn)物T-A克隆后測(cè)序，序列比對(duì)分析表明872 bp條帶的核酸序列PIP第一內(nèi)含子沒(méi)有被剪接，711 bp是內(nèi)含子剪接后的條帶，說(shuō)明改造的載體PIP-SA(M)-EGFP轉(zhuǎn)錄后PIP第一內(nèi)含子不剪切；改造載體PIP-EGFP和對(duì)照載體PIP-HindIII-EGFP一樣，第一內(nèi)含子發(fā)生剪切，但剪切不穩(wěn)定；并且測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，對(duì)照載體PIP-HindIII-EGFP條帶872 bp的核酸序列中還存在另一種剪切情況，剪接體序列為CCCCCAGGTCCTCACCCCCCGCCAAGCTTATGGTGAGC(刪除線表示剪切掉的序列，灰色突出表示HindIII識(shí)別序列)。

注：A．PIP-SA(M)-EGFP；B．PIP- EGFP；C．PIP-HindⅢ-EGFP；1．PE-F/R；2．β-actin-F/R；—：空白對(duì)照；M：DNA marker。

2.3 Western blot 檢測(cè)EGFP的表達(dá)

改造的兩種載體和對(duì)照載體轉(zhuǎn)染MIN-6胰島β細(xì)胞，2 d后收集細(xì)胞提取蛋白，酶標(biāo)測(cè)定濃度后以總蛋白量30 μg上樣，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：改造的兩種載體EGFP的蛋白表達(dá)量水平明顯高于對(duì)照載體，且改造載體PIP-SA(M)-EGFP的EGFP蛋白表達(dá)量明顯最高(見(jiàn)圖4)。

圖4 MIN-6 β細(xì)胞體外表達(dá)EGFP的Western blot 檢測(cè)

2.4 細(xì)胞流式分析

載體轉(zhuǎn)染1×106個(gè)MIN-6胰島β細(xì)胞，2 d后，采用0.1%的胰蛋白酶消化，然后用高糖DMEM培養(yǎng)液重懸，過(guò)70 μm細(xì)胞篩后，進(jìn)行細(xì)胞流式分析，結(jié)果表明：載體PIP-HindIII-EGFP、PIP-EGFP、PIP-SA(M)-EGFP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度分別為9.68、12.97、28.62，載體PIP-SA(M)-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞EGFP平均熒光強(qiáng)度極顯著高于另外兩個(gè)載體(P≤0.01，圖5)，該結(jié)果與Western blot檢測(cè)的結(jié)果一致，細(xì)胞流式分析散點(diǎn)圖見(jiàn)圖6。

圖5 MIN-6胰島β細(xì)胞流式分析的平均熒光強(qiáng)度

圖6 MIN-6胰島β細(xì)胞流式分析

3 討論

本研究利用豬胰島素基因啟動(dòng)子序列構(gòu)建EGFP表達(dá)載體，針對(duì)限制性內(nèi)切酶HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)在載體啟動(dòng)子中的位置不同構(gòu)建了三種表達(dá)載體，結(jié)果表明三種載體都能調(diào)控外源基因在胰島β細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。然而研究發(fā)現(xiàn)，在載體構(gòu)建中引入的HindIII酶切位點(diǎn)序列對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯造成了影響。

RNA拼接在真核生物基因表達(dá)過(guò)程中具有非常重要的作用，前體RNA經(jīng)過(guò)內(nèi)含子的剪切和拼接以后形成具有編碼信息功能的mRNA。RNA的剪接位置主要依賴于剪接位點(diǎn)的識(shí)別和GT-AG規(guī)則，載體PIP-HindIII-EGFP測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了異常的內(nèi)含子剪接，可能是由于HindIII酶切位點(diǎn)位置剛好產(chǎn)生了一個(gè)新的內(nèi)含子剪接位點(diǎn)5′-GU…A…AG-3′，在內(nèi)含子剪接過(guò)程中拼接位點(diǎn)不能正確識(shí)別，從而導(dǎo)致內(nèi)含子剪接紊亂的現(xiàn)象。而載體PIP-SA(M)-EGFP中用HindIII位點(diǎn)對(duì)第一內(nèi)含子3′端拼接位點(diǎn)進(jìn)行了突變，使第一內(nèi)含子不剪接，形成穩(wěn)定的表達(dá)。

真核生物基因的表達(dá)翻譯在很大程度上依賴其翻譯起始位點(diǎn)周圍的Kozak結(jié)構(gòu)。Kozak序列在翻譯起始中發(fā)揮重要的識(shí)別作用，借助Kozak序列搜索識(shí)別起始密碼子并啟動(dòng)翻譯。Kozak序列的簡(jiǎn)并形式表示為NN(G/A) NNATGG，已廣泛應(yīng)用于真核基因表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)，且不影響目的蛋白的性質(zhì)和功能。本研究中發(fā)現(xiàn)原胰島素外顯子2的起始密碼子前包含了Kozak調(diào)控序列，載體PIP-HindIII-EGFP中HindIII酶切位點(diǎn)插入在起始密碼子ATG之前，破壞了Kozak序列，而另兩種表達(dá)載體的設(shè)計(jì)保存了Kozak序列的完整，因此載體PIP-HindIII-EGFP調(diào)控的EGFP的熒光明顯最弱，蛋白翻譯效率最低。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)表達(dá)載體的體外表達(dá)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，載體構(gòu)建過(guò)程中導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)對(duì)PIP內(nèi)含子的剪切造成影響，從而影響了蛋白翻譯效率，這與以往研究結(jié)果一致。Watanabe等[13]利用豬胰島素啟動(dòng)子構(gòu)建載體，其載體的設(shè)計(jì)與本研究中的載體PIP-EGFP相似，即將載體構(gòu)建中連接PIP和目的基因的酶切位點(diǎn)刪除，實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子和下游基因間的無(wú)縫連接，值得關(guān)注的是，Watanabe構(gòu)建的載體在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)，但是在其制備的轉(zhuǎn)基因小鼠中卻未能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)。針對(duì)這一結(jié)果，本研究對(duì)載體中內(nèi)含子拼接位點(diǎn)進(jìn)行了突變，從而提高了翻譯效率。Grzech等[14,15]構(gòu)建的胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)載體，將PIP第一內(nèi)含子的剪接受體位點(diǎn)(SA)突變成了HindIII酶切位點(diǎn)，此載體的構(gòu)建與本研究中載體PIP-SA(M)-EGFP相似，Grzech利用其構(gòu)建的載體獲得了外源基因能夠在胰島中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠和豬，但并沒(méi)有對(duì)拼接位點(diǎn)的改變進(jìn)行相關(guān)研究。本試驗(yàn)結(jié)果明確表明將內(nèi)含子剪接受體位點(diǎn)突變?yōu)镠indIII序列對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)生了影響，我們對(duì)這種結(jié)果的原因進(jìn)行了分析?？傊?，本研究通過(guò)突變胰島素啟動(dòng)子第一內(nèi)含子的3′端的剪接受體位點(diǎn)，成功獲得了胰島β細(xì)胞的高效表達(dá)載體，為后續(xù)目的基因在轉(zhuǎn)基因豬胰島中特異表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)糖尿病小型豬模型的建立及糖尿病研究和治療具有重大的意義。

(本文圖2見(jiàn)彩插5。)

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