高建平，李玩生，曾爽，房永祥，馮海燕，楊孝樸，景志忠

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

由于豬的解剖學(xué)和生理學(xué)與人極為相似，除用于獸醫(yī)學(xué)研究之外，已廣泛用于人類的生理學(xué)、生物學(xué)及特有疾病的研究。但由于普通豬的體型過(guò)大，并不利于其微生物控制和實(shí)驗(yàn)操作，所以小型豬的培育及應(yīng)用成為國(guó)內(nèi)外研究的方向[1]。合作豬是我國(guó)青藏高原地區(qū)珍貴的地方品種種質(zhì)資源，與目前已開發(fā)的各種實(shí)驗(yàn)用小型豬相比具有諸多獨(dú)特的生物學(xué)特性[2]。我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)10多年對(duì)合作豬的近交培育，初步獲得了3個(gè)家系的小型豬用于疫病病原致病機(jī)制研究。由于小型豬的遺傳特性特別是免疫遺傳學(xué)特征與抗病性關(guān)系密切，故開展了其免疫相關(guān)關(guān)鍵分子如T細(xì)胞受體(TCR)、主要組織相容性復(fù)合物(MHC)以及細(xì)胞因子家族等分子的基因結(jié)構(gòu)研究，擬為其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供依據(jù)。

T細(xì)胞是一類介導(dǎo)細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵活性細(xì)胞，其細(xì)胞表面有多種不同的標(biāo)志，其中TCR作為一種細(xì)胞表面受體在獲得性免疫功能中發(fā)揮著非常重要的作用[3]。多數(shù)TCR是由α、β肽鏈組成的異二聚體即TCRαβ。在病原抗原識(shí)別上，TCRαβ可特異地識(shí)別由抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面MHC I類或MHC II類分子呈遞的抗原肽，從而啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)。TCR基因具有大量的V區(qū)和一些D區(qū)以及J區(qū),在重排的過(guò)程中,不同的組合以及結(jié)合過(guò)程中核苷酸的隨機(jī)插入(N區(qū))等可以構(gòu)成大量的識(shí)別不同抗原的TCR庫(kù)[3-5]。

20世紀(jì)80年代以來(lái),TCR的研究大多集中在小鼠和人類，豬的研究很少[5-8]。隨著對(duì)免疫學(xué)研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn)家畜如豬、牛和羊與小鼠和人類的免疫細(xì)胞在種類和組成比例上有明顯的差異[9-10]，TCR作為T細(xì)胞的關(guān)鍵識(shí)別分子是否相同還不完全清楚。鑒于此,本研究開展了豬淋巴細(xì)胞的TCRα鏈基因(簡(jiǎn)稱STA基因)克隆和生物學(xué)信息學(xué)分析工作,以明確合作豬TCRα鏈的基因結(jié)構(gòu)和多樣性特征，為豬病防控以及作為人類生命科學(xué)研究的動(dòng)物模型提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

JM109菌種、ThermoScript TM RT-PCR kit、Trizol reagent等均購(gòu)自Invitrogen公司; pGEM-Teasy載體、T4 ligase等購(gòu)自Promega公司;rTaq酶、EcoR I酶、DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司; DNA marker DL2000購(gòu)自廣州東盛生物技術(shù)有限公司;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

試驗(yàn)豬：本實(shí)驗(yàn)室【SYXK(甘)2010-0001】。近交培育的合作小型豬(F8)，3月齡1公1母。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌采集小型豬新鮮外周血、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，淋巴細(xì)胞的分離、計(jì)數(shù)和培養(yǎng)見文獻(xiàn)4。

1.2.2 總RNA的提取

取上述分離的細(xì)胞，用Invitrogen公司的Trizol reagent提取試劑盒提取總RNA,操作方法嚴(yán)格按試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行,提取的總RNA置-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI/GenBank上公開的豬T細(xì)胞受體α鏈基因序列(STA1:AB087988；STA2:AB087990)，用Oligo6.0軟件在其閱讀框兩端設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物。引物序列合成如下： STA1參考序列上游引物T1：5′- TGCTTCCTGCCACTCACTCAGT-3′，下游引物T2：5′- GCGGCTGTGGTCCAGCTGA-3′； STA2參考序列上游引物：T3：5′-ATGAAGCCCACCCTCATCTCA-3′，下游引物：T4：5′-TCAGCTGGACCACAGCCG-3′。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng)

在0.5 mL PCR反應(yīng)管中加入如下試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：RNA懸液2 μL, Oligo (dT)20 (50 μmol/L) 1 μL,10 mmol/LdNTPMix 2 μL, DEPC水7 μL,混勻后70℃預(yù)變性5 min, 瞬時(shí)離心后迅速置于冰上;然后加入5×cDNA合成緩沖液4 μL, 0.1 mol/L DTT 1 μL, ThermoScriptTMRT (15 U/μL) 1 μL, RNase-OUTTM (40 U/μL) 1 μL, DEPC水1 μL,置微量離心機(jī)離心混勻后, 55℃水浴反應(yīng)45 min, 85℃滅活5 min；然后加入RNase-H (2 U/μL) 1 μL, 37℃ 20 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR反應(yīng)

在25 μL反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.3 μL, 10× buffer I 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTP mixture 4 μL, T1/T3上游引物和T2/T4下游引物 (50 pmol/μL)各0.25 μL,滅菌去離子水17.45 μL, rTaqDNA聚合酶0.25 μL。擴(kuò)增參數(shù)為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃ 1 min、65～67℃ 50 s、72℃ 90 s, 35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.2.6 克隆與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳,回收目的DNA片段, 與pGEM-T easy載體相連接, 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞, 然后涂布含氨芐青霉素(100 μg/mL)的平板,挑取單個(gè)菌落,接種LB中37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜,提取的質(zhì)粒經(jīng)凝膠電泳及EcoRI酶切鑒定后，送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.7 生物信息學(xué)分析

利用SignalP 3.0 Server-prediction、DNAStar、SMART、IMGT/V-QUEST等生物軟件, 應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)克隆分子的遺傳演化關(guān)系和序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 STA基因的擴(kuò)增與序列分析

將STA1和STA2參考序列的特異性引物擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果均可見在750 ～1000 bp之間出現(xiàn)一條特異性擴(kuò)增條帶(圖1、圖2)。將克隆片段的陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，所得的基因序列通過(guò)與參考序列的比對(duì)以及BLAST的同源性搜索后確定，克隆的93個(gè)基因序列為豬T細(xì)胞受體α鏈基因，統(tǒng)一命名為STA1-STA93，其中基因克隆STA1-STA68來(lái)自豬外周血淋巴細(xì)胞，STA69-STA78來(lái)自豬腸系膜淋巴結(jié)，STA79-STA93來(lái)自脾臟淋巴細(xì)胞。

將93個(gè)基因序列整體分析發(fā)現(xiàn)，其中79個(gè)序列含有較大的完整的開放閱讀框，14個(gè)序列只含一個(gè)較小的開放閱讀框，這些閱讀框較小的序列主要擴(kuò)增自豬外周血和脾臟的淋巴細(xì)胞。

注：1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.豬外周血STA1 PCR 產(chǎn)物；3.豬淋巴結(jié)STA1 PCR 產(chǎn)物；4.豬脾臟STA1 PCR 產(chǎn)物。

注：1.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.豬外周血STA2 PCR 產(chǎn)物；3.豬淋巴結(jié)STA2 PCR 產(chǎn)物；4.豬脾臟STA2 PCR 產(chǎn)物。

2.2 STA基因的同源性比較

利用DNAStar和MEGA等軟件進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，STA1～93基因間核苷酸的同源性在68.4%～98.7%之間(見STA1～16分析表1，其他略)。根據(jù)核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果，將STA1～5、STA11、STA13～18、STA20、STA23～25、STA27～28、STA46～68、STA91～STA93歸為一亞類，將其余的49個(gè)基因序列再歸為一亞類，分別命名為STAI和STAⅡ(圖略)，這與所用的STA1和STA2特異性引物擴(kuò)增無(wú)關(guān)。

2.3 STA基因的基本結(jié)構(gòu)與多樣性分析

對(duì)分類的STA I和STA II基因的全長(zhǎng)通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，STA I類基因除STA43和STA85基因之外(以下均不包括這兩個(gè)基因)，基因序列在第1～320位差異比較小，這一位置主要包括基因的信號(hào)肽、FR1區(qū)、CDR1區(qū)、FR2區(qū)、CDR2區(qū)和FR3區(qū)前部分，為TCRα鏈的V區(qū)的絕大部分序列?；蜷g序列的主要差異集中在第320～400位，這一位置包括FR3區(qū)后部分和CDR3區(qū)，主要為TCRα鏈的V區(qū)的小部分序列和整個(gè)J區(qū)。第401位以后相對(duì)比較保守，為TCRα鏈的C區(qū)。

表1 STA1～16基因核苷酸序列同源性比較

對(duì)于STA I類基因，在信號(hào)肽區(qū)(約1～57位)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)主要變異位點(diǎn)。在FR1區(qū)和CDR1區(qū)(約第58～150位)，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)變異位點(diǎn)，這一區(qū)域主要變異熱點(diǎn)在STA3、17、20、27、91等基因序列。FR2區(qū) 和CDR2區(qū)(約第151～250位)發(fā)現(xiàn)8個(gè)變異位點(diǎn)。FR3區(qū)和CDR3區(qū)(約第251～400位)序列的差異很大，后面將作詳細(xì)分析。C區(qū)(第401～825位)相對(duì)比較保守，有21個(gè)變異位點(diǎn)。

STA II基因結(jié)構(gòu)分區(qū)與STA I類基因基本相似。將這49個(gè)基因的核苷酸序列比較發(fā)現(xiàn)，STA22和STA74與其他47個(gè)基因的核苷酸序列不同，在其第45～59位間多了14 bp的堿基(ATCTTTCTTTTCTA)。對(duì)除這兩個(gè)基因之外的47個(gè)基因的分析發(fā)現(xiàn)：在信號(hào)肽區(qū)(約第1～57位)主要有5個(gè)變異位點(diǎn)。在FR1區(qū)和CDR1區(qū)(約第58～150位)，發(fā)現(xiàn)主要有6個(gè)變異位點(diǎn)。這一組基因的FR2區(qū)和CDR2區(qū)(約第151～250位)變異點(diǎn)比較集中，主要分布在第166位，另外有17個(gè)基因在169～170位多了AT兩個(gè)堿基。同樣FR3區(qū)和CDR3區(qū)(約第251～420位)序列的差異很大，后面將作詳細(xì)分析。這類基因的C區(qū)(第401～825位)也比較保守，有16個(gè)變異位點(diǎn)。

2.4 STAV序列與人類TRAV的相似性比較

在核苷酸水平，對(duì)STA1～93基因V區(qū)(STAV)用IMGT/V-QUEST軟件與其數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類TRAV基因序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)STAV1、2、3等39個(gè)基因與人類TRAV16*01的相似性最高，均在80%以上。STAV6、7、10等34個(gè)基因與人類TRAV18*01的相似性較高，在75%以下。STAV8等13個(gè)基因與TRAV8-4*07相似性較低，均在65%以下。

在氨基酸水平，將克隆的93個(gè)STAV推導(dǎo)編碼的氨基酸序列與IMGT中的人類TRAV的進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與人類相似性最高的序列為TRAV16*01、TRAV18*01、TRAV8-4*01(表2)。選擇代表性的STAV1、STAV6、STAV21分別作相似性分析發(fā)現(xiàn)，STAV1與 TRAV16*01相似性為84.67%，STAV6 與TRAV18*01相似性為73.3%，STAV21與 TRAV8-4*01相似性為60.22%(圖3～5)。

2.5 STAJ序列與人類TRAJ的相似性比較

同樣將88個(gè)含有豬STA基因JUNCION區(qū)(即連接區(qū)，簡(jiǎn)稱STAJ)的序列與人類的TRAJ進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與人類TRAJ序列同源性達(dá)85%以上的STAJ序列有23個(gè)，其中最高可達(dá)92.54%。88個(gè)STAJ序列按相似度對(duì)應(yīng)人類TRAJ的有43個(gè)，一種人類TRAJ如TRAJ10*01、24*02、36*01和48*01對(duì)應(yīng)的STAJ序列最多為5個(gè)，并且對(duì)應(yīng)同一TRAJ序列如TRAJ10*01的STAJ間的相似度很高，但并不完全相同。對(duì)照STAV序列的相似度分析發(fā)現(xiàn)，與STAV序列對(duì)比結(jié)果不同的是STAJ序列分散度很大，兩者并無(wú)相關(guān)性，這可能與人類V區(qū)和J區(qū)的分子結(jié)構(gòu)組成機(jī)制不同有關(guān)(表2，3)。

在氨基酸水平上，對(duì)88個(gè)STAJ序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些序列的J區(qū)絕大部分能形成正常閱讀框(in-frame)，一般由9～18氨基酸組成。序列除前兩個(gè)氨基酸均為半胱氨酸和丙氨酸，最后一個(gè)氨基酸主要為苯丙氨酸外，其他氨基酸均有非常復(fù)雜的多態(tài)性變化，這一分析結(jié)果與人類TRAJ的結(jié)果相一致(表2)。

表2 STA1～50基因V區(qū)、J區(qū)推導(dǎo)氨基酸序列及與人類的分子結(jié)構(gòu)特征比較

圖3 STAV1序列與人的TRAV16*01相似性分析

圖4 STAV6序列與人的TRAV18*01相似性分析

圖5 STAV21序列與人的TRAV8-4*07相似性分析

3 討論

3.1 豬TCRα鏈基因的基本結(jié)構(gòu)與多樣性

根據(jù)GenBank上登錄的豬T細(xì)胞受體α鏈的基因序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)利用兩對(duì)特異性引物從小型豬外周血、脾臟和淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞中成功擴(kuò)增和克隆鑒定了豬TCRα鏈基因STA1～93，而且每個(gè)基因序列各不相同，絕大部分基因顯示了豐富的多態(tài)性和多樣性。除擴(kuò)增的較小片段基因序列(缺失V區(qū))外，全長(zhǎng)ORF的基因序列都含有一個(gè)可變的V區(qū)、高變的J區(qū)和恒定的C區(qū)基因結(jié)構(gòu)，并能形成與pMHC復(fù)合物結(jié)合的CDR1、CDR2和CDR3關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，這符合TCR基因的譜系發(fā)育、基因重排和分子結(jié)構(gòu)組成特征[4,6,7]。

表3 STAJ序列與人類TRAJ的相似性比較

同時(shí)，對(duì)全長(zhǎng)ORF的STA基因的核苷酸序列的信號(hào)肽區(qū)、FR1區(qū)、CDR1區(qū)、FR2區(qū)、CDR2區(qū)、FR3區(qū)和CDR3區(qū)進(jìn)行分區(qū)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，還存在非常復(fù)雜的多態(tài)性和多樣性。其中大多數(shù)變異位點(diǎn)多集中于CDR3區(qū)和接近這一功能區(qū)的FR3區(qū)，其他區(qū)域相對(duì)較少，這與Arden等[7]的分析結(jié)果一致。這些區(qū)域序列的變異位點(diǎn)大部分屬于等位基因的多態(tài)性，而CDR3區(qū)和接近這一功能區(qū)的FR3區(qū)的大量變異位點(diǎn)屬于TCR多樣性的具體體現(xiàn)，這與TCR基因重排或非模板的隨機(jī)插入特性相關(guān)，由此也充分表明了豬TCRα鏈的多樣性特征[11-12]。

3.2 豬TCRα鏈分子與人類的遺傳演化關(guān)系

STA1～93基因V區(qū)分別與人類TRAV基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，STAV1、2、3等39個(gè)基因與TRAV16*01相似性在80%以上，STAV43和STAV85與TRAV2*01和TRAV2*02相似性在80%以上，STAV6、7、10等34個(gè)基因與TRAV18*01相似性在70%以上，STAV8等13個(gè)基因與TRAV8-4*07和TRAV8-4*06也有較大的相似性，說(shuō)明豬TCRα鏈V區(qū)與人類的遺傳演化關(guān)系較近。因此，可依據(jù)Yamamoto等[8]的人類TRA的分類方法，將克隆鑒定的93個(gè)STA基因歸類。

T細(xì)胞受體α鏈的J區(qū)是其變異程度最大的區(qū)域，也是CDR3區(qū)形成的最關(guān)鍵的部位，STAJ與人類TRAJ的相似性比較更能體現(xiàn)其遺傳演化關(guān)系。STAJ推導(dǎo)編碼氨基酸的相似性比較發(fā)現(xiàn)，雖然不同STAJ間序列差異性很大，但在88個(gè)STAJ序列中按相似度對(duì)應(yīng)人類TRAJ序列有43個(gè)，其相似性均在70%以上，甚至高達(dá)92.54%。這說(shuō)明STAJ序列雖然在物種內(nèi)多樣性豐富，但在遺傳上還與人類的TRAJ關(guān)系密切。

3.3 豬TCRα鏈分子的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能關(guān)系

TCRαβ 作為T細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合由抗原遞呈細(xì)胞(APC)遞呈的MHC-抗原肽分子的重要表面受體，主要由保守的框架區(qū) (FRs)和多態(tài)性的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)組成。由V基因片段編碼的CDR1和CDR2主要負(fù)責(zé)與MHC分子結(jié)合，而由V-(D)-J 編碼的CDR3主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原肽。已證實(shí)人類TCRα鏈 V基因成分由44～46 個(gè)功能性的TRAV組成[13]，絨猴(Callithrixjacchus) 的TCR α鏈由1個(gè)恒定的C、46個(gè)J和35個(gè)V基因片段組成[14]。Yamamoto等[8]首次報(bào)道擴(kuò)增了103個(gè)完整的豬TRA cDNA，其中含33個(gè)不同的TRAV基因，后根據(jù)人類TRAV基因?qū)⑵錃w類為20個(gè)亞類，其中13個(gè)亞類只含一個(gè)成員，最多的亞類含12個(gè)成員。目前，我們已克隆鑒定豬TCRα鏈基因93個(gè)，而且每個(gè)基因各不相同，但豬TCRα鏈究竟由多少個(gè)V、J和C基因片段組成，還不能確定。但可以肯定是，合作小型豬TCRα基因具有十分豐富的多態(tài)性和多樣性，能夠適應(yīng)外界復(fù)雜環(huán)境的免疫學(xué)反應(yīng)需要。

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