張倩華 (廣西那坡縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 坡縣 533900)

副溶血性弧菌是一種嗜鹽性、引起人類腸胃炎的革蘭陰性菌，通常棲息于溫暖的海洋或河口環(huán)境中，與貝類有共生關(guān)系，帶有毒力基因的菌株嚴(yán)重污染貝類［1］。近年來，由于貿(mào)易全球化，副溶血弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢［2］。因此，早期診斷、及時預(yù)防和治療是控制該病的關(guān)鍵。副溶血性弧菌實驗室診斷常用的方法有細(xì)菌培養(yǎng)、分離及生化和血清學(xué)鑒定，免疫學(xué)檢測，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)等。本文將副溶血性弧菌檢測技術(shù)進(jìn)展綜述如下。

1 細(xì)菌培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是實驗室檢測副溶血性弧菌的傳統(tǒng)方法。國標(biāo)GB/T 4789.7-2008的檢測步驟是樣品經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌后轉(zhuǎn)種硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(TCBS)瓊脂或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，于37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，挑選可疑菌落作生化試驗或選用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK進(jìn)行鑒定［3］。凌秀梅等［4］按國標(biāo)采用TCBS瓊脂培養(yǎng)分離結(jié)合傳統(tǒng)生化試驗鑒定與科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合API20E生化鑒定作對比檢測，兩種方法檢測結(jié)果一致，科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合API20E法在檢測時間和操作步驟方面要優(yōu)于前者。培養(yǎng)法不需要貴重設(shè)備，基層實驗室都可以開展，但操作復(fù)雜、耗時4～7 d、特異性和敏感性不高。

2 免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測是根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原。血清學(xué)反應(yīng)常用于副溶血性弧菌的血清學(xué)分型鑒定［5］，酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)、免疫熒光技術(shù)［6］、免疫印跡［7］等也有學(xué)者應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測研究。

ELISA法具有快速、敏感、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，是免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)［8］，其基本原理是酶標(biāo)記抗體與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)，根據(jù)顯色的深淺定性或定量地檢測樣本中的抗體或抗原。張蕾等［9］制備副溶血性弧菌鞭毛蛋白單克隆抗體并建立雙抗夾心ELISA，對134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌進(jìn)行特異性實驗，結(jié)果表明134株副溶血性弧菌呈陽性反應(yīng)，74株非副溶血性弧菌呈陰性反應(yīng)，該方法的檢測靈敏度達(dá)到l×103CFU/ml菌液，與所測試的非副溶血性弧菌沒有交叉反應(yīng)。

3 基因擴(kuò)增技術(shù)

基因擴(kuò)增技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究手?jǐn)?，人們已建成了多種方法，其中PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是眾多方法中較為常用于檢測副溶血性弧菌的方法。研究表明，大多數(shù)副溶血性弧菌對人類不會致病，僅有少數(shù)攜帶耐熱性溶血毒素(Thermostable direethemolysin，TDH)或TDH相關(guān)溶血毒素(TDH related hemolysin，TRH)或兩者都有的副溶血性弧菌可以引起人類疾?。?0］。最簡單和最常用的診斷副溶血性弧菌是否具有致病性的指標(biāo)是檢測TDH和TRH基因［2］。此外，不耐熱溶血素基因(tlh)、groEL和 toxR［11-13］基因普遍存在于臨床和環(huán)境中的副溶血性弧菌中，許多研究將其作為檢測副溶血性弧菌菌種特異性基因。

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù):聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)又稱無細(xì)胞克隆技術(shù)，是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增技術(shù)。目前，臨床上用副溶血性弧菌特異性高的毒力基因作為靶基因，常用的PCR有常規(guī)PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR(RAPD-PCR)、PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(PCR-ELISA)、多重PCR和實時熒光定量PCR等。

常規(guī)PCR檢測副溶血性弧菌只需要設(shè)計一對相應(yīng)的引物，擴(kuò)增后用凝膠電泳鑒定［14］。RAPD-PCR的引物是隨機(jī)合成或任意選定，長度一般為9～10個寡核苷酸［15］。PCRELISA是應(yīng)用生物素標(biāo)記引物，PCR擴(kuò)增時，其產(chǎn)物結(jié)合到親和素包被的塑料板上，再用地高辛標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交，然后用抗地高辛的酶聯(lián)反應(yīng)檢測。Kumar等［16］針對具有TRH的副溶血性弧菌純化重組蛋白，制備單克隆抗體4B10，建立夾心PCR-ELISA法用于檢測海產(chǎn)樣品，結(jié)果靈敏度高且快速。多重PCR是在同一反應(yīng)管中同時加上兩對以上的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可對副溶血性弧菌基因進(jìn)行分型。Hossain等［17］針對groEL、TDH和TRH基因設(shè)計引物，建立多重PCR檢測海產(chǎn)樣本中副溶血性弧菌，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物分別為510 bp、382 bp和171 bp的DNA片段，該方法最低檢出限為200個DNA/pg。上述常規(guī)PCR、RAPD-PCR、PCR-ELISA和多重PCR等均不能作定量分析，擴(kuò)增后需用凝膠電泳鑒定，操作比較繁瑣，同時擴(kuò)增產(chǎn)物極易受到污染造成假陽性。實時熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用對熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。常用于檢測副溶血性弧菌的熒光物質(zhì)包括熒光探針和熒光染料。Tyagi等［18］采用熒光染料(SYBR Geenl)作熒光基團(tuán)，以副溶血性弧菌TDH基因設(shè)計引物，建立實時熒光定量PCR，該方法的最低檢出限量為每個副溶血性弧菌DNA 0.1 pg，R2值＞0.99，連續(xù)三天測試，其變異系數(shù)范圍是1.2%～4.2%。龔璞等［19］用副溶血性弧菌TDH基因設(shè)計引物，建立Taq Man-MGB探針實時熒光PCR方法檢測1株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株和44株副溶血性弧菌環(huán)境分離株的循環(huán)域值 (Ct值)均＜35，未增菌樣品的最低檢測下限為 25 cfu/ml，經(jīng)6 h增菌后的下限菌量為2.5 cfu/ml;同時檢測24株志賀菌、20株沙門菌、14株大腸桿菌、11株金黃色葡萄球菌，Ct值均＞35或無Ct值;經(jīng)過3次重復(fù)試驗，其Ct值的變異系數(shù)均＜5%。實時熒光PCR簡化了傳統(tǒng)PCR方法，實時檢測采用完全閉管、熒光探針標(biāo)記特定核酸的方法，避免了污染，并實現(xiàn)定量分析，準(zhǔn)確性更高。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù):環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是 Notomi等［20］針對副溶血性弧菌的TDH和TRH基因設(shè)計引物，開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，于2000年首次報道。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，該引物由內(nèi)引物對(正向內(nèi)引物)和向后內(nèi)引物)和外引物對(向前外引物和向后外引物)組成。內(nèi)引物包含識別和抗識別鏈的靶序列，而外引物僅含有抗識別鏈的靶序列。在LAMP第一步驟中，一條內(nèi)引物啟動鏈置換合成，通過外引物的退火將在同一靶鏈和后續(xù)合成的互補(bǔ)鏈產(chǎn)生的新產(chǎn)物鏈替換。以替換的產(chǎn)物鏈作為模板，通過第二內(nèi)引物和外引物雜交形成的另一端靶DNA合成莖-環(huán)狀的新鏈結(jié)構(gòu)。第二輪LAMP反應(yīng)以莖-環(huán)狀新鏈作為模板開始鏈置合成，產(chǎn)生新的莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，其中一個產(chǎn)物DNA長度增加兩倍;反應(yīng)繼續(xù)，重復(fù)積累，產(chǎn)物DNA是擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列，擴(kuò)增的最后產(chǎn)物具有不同個數(shù)莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)。反應(yīng)時間不到1 h，并產(chǎn)生109拷貝的靶DNA［21］。

目前臨床上有許多學(xué)者進(jìn)行LAMP技術(shù)應(yīng)用于檢測副溶血性弧菌研究。Yamazaki等［22］根據(jù)副溶血性弧菌TDH基因和TRH亞型基因(trh1、trh2)設(shè)計特異性引物，該方法將tdh、trh1、trh2基因設(shè)計成聯(lián)合和單個檢測，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。他們建立的LAMP體系具有高度特異性，對125株副溶血性弧菌、3株霍利斯格里蒙菌及2株攜帶tdh、trh1、trh2基因的擬態(tài)弧菌進(jìn)行檢測，與用DNA探針和常規(guī)PCR檢測的結(jié)果一致，對20株缺乏TDH、trh1和trh2基因的任何一株細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增時均為陰性，該方法僅需要27～60 min，簡單快速。吳家林等［23］針對副溶血性弧菌不耐熱溶血素(tlh)基因和tdh設(shè)計兩套引物，建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測方法，用PCR法作比較，并進(jìn)行了蝦肉模擬樣品和實際樣品檢測。結(jié)果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)特異性和靈敏度高于PCR法，對細(xì)菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度為101cfu/ml，對蝦肉模擬樣品檢測靈敏度103cfu/g。而PCR法的靈敏度分別為102cfu/ml和105cfu/g。采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在69份實際樣品中檢測出11份tlh基因陽性，其中2份tdh毒力基因陽性。由于副溶血性弧菌的toxR基因編碼序列的內(nèi)膜“系鏈”區(qū)域具有高度特異性，可用于區(qū)分不同的弧菌，Chen S等［24］針對副溶血性弧菌toxR基因，設(shè)計了5種引物，建立LAMP核酸擴(kuò)增基因技術(shù)，對36株副溶血性弧菌和39株其他細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測，并用牡蠣作加標(biāo)試驗，同時用toxR-PCR法作對比檢測，結(jié)果toxRLAMP法在每個純培養(yǎng)反應(yīng)的最低檢出限為47～470個細(xì)胞，加標(biāo)試驗，能夠檢測出每克牡蠣含1.1×105個副溶血性弧菌細(xì)胞，敏感性均比toxR-PCR法高100倍，在這兩種純培養(yǎng)和加標(biāo)牡蠣樣品檢測副溶血性弧菌產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示細(xì)胞數(shù)和熒光或濁度信號之間呈良好的線性關(guān)系。

LAMP具有操作簡單、快速、特異性強(qiáng)等特點，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于實時熒光定量PCR，也不需要昴貴的儀器設(shè)備即可開展，目前已應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲和食品安全的檢測［25］。

目前，臨床上檢測副溶血性弧菌的常用方法仍為細(xì)菌培養(yǎng)法，因其所需設(shè)備要求不高，已在基層實驗室廣泛應(yīng)用，但操作復(fù)雜、費(fèi)時，不能做到早期診斷。免疫學(xué)方法因其靈敏性和特異性尚不理想，而且試盒成本高，目前還不為臨床廣泛接受。DNA探針法費(fèi)時且操作繁雜。常規(guī)PCR分析雖然提供了快速檢測，但需瓊脂糖凝膠電泳，也耗時、繁瑣。近年來興起的實時PCR檢測比常規(guī)PCR檢測更快速，但需要昂貴的設(shè)備，檢測費(fèi)用高，限制其在基層實驗室廣泛使用。最近發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)可作一步法基因擴(kuò)增進(jìn)行簡單的濁度分析，不需要高度精確和昂貴的設(shè)備，只需要一個簡單的恒溫水浴箱即可開展工作，比PCR法檢測更快，更容易執(zhí)行。隨著LAMP技術(shù)的不斷完善，在副溶血性弧菌診斷上將具有良好的應(yīng)用前景。

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