蒙 萍，馬慧萍，景臨林，樊鵬程，賈正平

線粒體功能障礙是很多疾病產(chǎn)生的原因，而氧化應(yīng)激又是引起線粒體功能障礙的主要原因，大量自由基、活性氧造成線粒體膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)硝化，損傷線粒體DNA、線粒體膜結(jié)構(gòu)和電子傳遞鏈酶復(fù)合物，使氧化磷酸化減弱或不能進(jìn)行，ATP產(chǎn)生迅速減少，觸發(fā)進(jìn)一步的線粒體損傷。因此，抗氧化劑被認(rèn)為能夠有效改善線粒體功能障礙。然而，基于線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)，使得大多數(shù)藥物不能穿過其雙層膜到達(dá)線粒體內(nèi)部發(fā)揮作用，人們開始研究線粒體靶向抗氧化劑來治療相關(guān)疾病。過去20年中，在線粒體靶向抗氧化劑方面取得了一定的進(jìn)展，如以合適的載體與抗氧化劑結(jié)合成靶向復(fù)合物、將抗氧化劑修飾和包裝成納米粒等［1］，其中一個(gè)很好的方法是結(jié)合陽離子脂質(zhì)體，如三苯基磷。磷的衍生物已經(jīng)被傳統(tǒng)的用于靶向藥物的設(shè)計(jì)，使藥物有靶向線粒體內(nèi)膜的特性。MitoQ由三苯基磷陽離子(TPP+)與輔酶Q10通過一個(gè)十碳脂肪鏈共價(jià)結(jié)合組成［2］，在線粒體膜電位的驅(qū)動(dòng)下，MitoQ的TPP+部分誘導(dǎo)其快速穿過線粒體膜，被線粒體迅速廣泛攝取而聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi)，隨后不斷地被線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ轉(zhuǎn)變成具有抗氧化活性的泛醇的形式［2-3］。MitoQ在動(dòng)物和人體中均具有口服的生物利用度［4］，能夠通過降低線粒體活性氧的水平，減少線粒體蛋白、脂質(zhì)和 DNA氧化損傷而保護(hù)線粒體。

1 MitoQ的結(jié)構(gòu)及其靶向機(jī)制

輔酶Q10是組成呼吸鏈的必需成分，是電子傳遞鏈中的遞氫體，為線粒體合成 ATP的必要成分［5］，在人體內(nèi)分布廣泛，含量差別較大，在肝、腎、心的含量較高，主要來源于食物補(bǔ)充和自身合成，是唯一一個(gè)可以內(nèi)源性合成的脂溶性抗氧化劑［5-6］。在細(xì)胞內(nèi)，輔酶Q10位于膜的磷脂雙分子層中間，有3種存在狀態(tài):全氧化型(CoQ10)，半泛醌自由基型(CoQ10H·)，全還原型(CoQ10H2)，只有還原型輔酶Q10可以發(fā)揮抗氧化作用［7-8］。近年來越來越多的研究顯示，還原型輔酶Q10可以清除體內(nèi)多種自由基、抑制蛋白和DNA的氧化、穩(wěn)定心肌鈣依賴性離子通道，還可以與維生素E協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用。但是由于線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)，外源性的輔酶Q10不能最大程度發(fā)揮其抗氧化作用，因此線粒體靶向輔酶Q10成為近年來抗氧化劑研究的熱點(diǎn)。

MitoQ是目前研究最多和應(yīng)用最廣泛的線粒體靶向抗氧化劑，由TPP+與輔酶Q10的苯醌部分通過一個(gè)十碳脂肪鏈共價(jià)結(jié)合構(gòu)成。三苯基磷陽離子是一個(gè)帶正電荷的磷原子被大的疏水表面所圍繞，使其能夠直接、迅速地穿過磷脂雙分子膜，促使TPP+聚集在細(xì)胞質(zhì)(10倍)中，同時(shí)保留其正電荷，使TPP+隨后在更大的線粒體膜電位(150～180 mV)的驅(qū)動(dòng)下穿過線粒體膜，聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi)(100～500倍)，較高的膜電位是氧化呼吸鏈中電子轉(zhuǎn)移給氧時(shí)產(chǎn)生的質(zhì)子梯度引起的［9］。多重證據(jù)表明MitoQ可以顯著的聚集在線粒體內(nèi)，然后被降解成可以發(fā)揮抗氧化活性的泛醇的形式。隨著泛醌部分深入地插進(jìn)膜的疏水性內(nèi)部，線粒體膜內(nèi)的基質(zhì)成為其主要吸收部位，使MitoQ可以不斷的清除過氧化氫、過氧亞硝酸鹽、超氧化物，保護(hù)線粒體對(duì)抗脂質(zhì)過氧化，其后又可以在線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ的作用下不斷地還原成具有抗氧化活性的泛醇的形式［10-11］。

2 MitoQ的藥理學(xué)作用

2.1 神經(jīng)退行性疾病 氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致活性氧和活性氮在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程，是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要機(jī)制。帕金森病(PD)是一種神經(jīng)退行性疾病，傳統(tǒng)的藥物只能減輕癥狀而不能徹底治愈，目前尚無非常有效的治療PD的藥物［4，12］。研究顯示，MitoQ 對(duì) PD 的細(xì)胞和動(dòng)物模型都有神經(jīng)保護(hù)作用，能顯著抑制6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞PD模型中Drp1向線粒體遷移，阻礙線粒體分裂機(jī)制的激活，同時(shí)抑制促凋亡蛋白 bax轉(zhuǎn)位到線粒體，抑制 PD 的發(fā)生［4，13］。另外，有研究顯示，在4 mg/(kg·d)的劑量下，MitoQ 能 抑 制 1-甲 基-4-苯 基-1，2，3，6-四 氫 吡 啶(MPTP)誘導(dǎo)的黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元和神經(jīng)末梢的丟失，減少多巴胺和其代謝物的丟失，抑制線粒體順烏頭酸酶的失活［9，14］，為 MitoQ 靶向線粒體發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用提供了一定依據(jù)。

2.2 代謝綜合征 代謝綜合征是指機(jī)體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生代謝紊亂在臨床出現(xiàn)一系列癥狀，一般包括胰島素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪肝、高血壓、心血管疾病和脂肪組織的堆積引起的促炎性反應(yīng)［15］。代謝綜合征的病因尚不十分明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與線粒體氧化應(yīng)激和相關(guān)炎性因子的異常表達(dá)相關(guān)［16］。氧化還原信號(hào)對(duì)線粒體新陳代謝十分重要，大量線粒體酶的活性可以被氧化還原所調(diào)節(jié)，脂肪細(xì)胞的分化就需要線粒體活性氧，這個(gè)過程可以被抗氧化劑阻斷［17］。在高脂飲食誘導(dǎo)大鼠代謝綜合征模型中發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激增加和內(nèi)皮功能障礙，而NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧的增加也伴隨著關(guān)鍵的抗氧化酶——超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)的下調(diào)，提示代謝綜合征患者抗氧化防御體系被打破，證明氧化應(yīng)激能促進(jìn)動(dòng)物模型中代謝征的發(fā)展［16］。

研究表明，在用高脂飼料喂食ATM+/-/ApoE-/-小鼠后，MitoQ可以降低線粒體活性氧水平，減少8-oxo-G在ATM+/-/ApoE-/-小鼠心臟、肝臟和胰腺的堆積，并通過降低線粒體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的氧化損傷保護(hù)線粒體［17］，顯著改善代謝綜合征的多個(gè)癥狀，改變糖類和脂質(zhì)代謝中的有害效應(yīng)，減少脂肪的堆積，減少血清膽固醇和甘油三酯的循環(huán)，改善高脂血癥，抑制肥胖和肝脂肪變性，使糖耐量正?；⑶也挥绊憴C(jī)體食物和水的攝入以及能量的消耗［17-18］。另外，有研究顯示，MitoQ幾乎可以完全恢復(fù)代謝綜合征Zucker肥胖大鼠模型中冠狀動(dòng)脈側(cè)支的血管生長［16］。

2.3 多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS) 軸索變性是MS的主要病理特征，被認(rèn)為與當(dāng)前臨床永久性致殘密切相關(guān)［19］。有研究認(rèn)為，脂質(zhì)和DNA的氧化程度與MS患者的腦部炎性損傷密切相關(guān)［20］?；蛉笔?、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和離子失調(diào)在MS的發(fā)病機(jī)制中都扮演著重要的角色［21］，細(xì)胞質(zhì)和線粒體鈣超載、活性氧的聚集引起的線粒體功能障礙，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或可溶性炎性介質(zhì)直接對(duì)軸突發(fā)起免疫攻擊都可能引起軸索變性［22］。大多數(shù)MS患者病情呈階段性發(fā)作，在初始階段(急性期)，主要是脫髓鞘作用，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤，通常由淋巴細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成，產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，破壞髓磷脂，造成軸突傳導(dǎo)障礙;MS晚期的特點(diǎn)主要是廣泛的皮質(zhì)脫髓鞘作用、神經(jīng)元損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變化［19］。

Niki＇等［23］發(fā)現(xiàn)外源性的抗氧化劑可以減緩線粒體功能障礙從而減弱軸索變性。由于MitoQ可以輕易地穿過血腦屏障、細(xì)胞質(zhì)和線粒體膜，具有潛在的抗氧化損傷作用，使得MitoQ成為一種很有潛力的治療 MS 方法［22］。Mao等［22］研究顯示，腹腔注射MitoQ預(yù)處理或治療自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠均能減少EAE相關(guān)的神經(jīng)損傷，顯著抑制EAE小鼠的神經(jīng)炎癥，抑制炎性細(xì)胞因子白介素6(IL-6)和趨化因子以及脫髓鞘作用，增加對(duì)軸突的保護(hù)作用。

2.4 缺血再灌注損傷 心肌缺血時(shí)，冠狀動(dòng)脈血流的中斷剝奪了心肌細(xì)胞的氧和葡萄糖的供應(yīng)，抑制氧化磷酸化，導(dǎo)致腺嘌呤核苷酸的丟失和磷酸鹽、脂肪酸、乳酸的堆積，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高以及胞內(nèi)pH值降低，損傷線粒體功能［24］。再灌注時(shí)，氧氣與受損的線粒體呼吸鏈相互作用，特別是與非偶聯(lián)復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ相互作用時(shí)產(chǎn)生的大量活性氧使線粒體損傷加劇。傳統(tǒng)的抗氧化劑因?yàn)椴荒馨邢蚓奂诖蠖鄶?shù)缺血再灌注損傷發(fā)生部位的線粒體內(nèi)，對(duì)心臟缺血再灌注的效果有限［25］。

MitoQ進(jìn)入線粒體被線粒體呼吸鏈復(fù)合物降解成其抗氧化活性形式泛醇，作用于心臟缺血再灌注。Ondrasik等［25］對(duì) MitoQ、SS31 等靶向抗氧化劑的抗心肌缺血再灌注損傷的作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，40μmol的線粒體靶向抗氧化劑MitoQ、SS31就可以在一定程度上抑制線粒體活性氧的產(chǎn)生，減弱心肌缺血再灌注損傷，改善心肌收縮功能障礙和減小梗死面積。當(dāng)冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)時(shí)，可以迅速、有效的發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用［25］。

2.5 膿毒癥 全世界膿毒癥的病死率為31%，超過70%的患者會(huì)繼發(fā)為膿毒癥誘導(dǎo)的多器官損傷［26］。膿毒癥時(shí)機(jī)體的抗氧化體系失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、大量的細(xì)胞色素釋放和線粒體功能障礙［27-28］。線粒體既是活性氧的產(chǎn)生部位也是活性氧介導(dǎo)損傷的靶點(diǎn)［27］，活性氧通過激活主要的信號(hào)通路，包括氧化還原敏感的核因子κB(NF-κB)和炎性小體轉(zhuǎn)錄因子通路，促進(jìn)炎性應(yīng)答，引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致器官功能障礙［26］。超氧化物和一氧化氮都可以通過形成過氧亞硝酸鹽在膿毒癥線粒體損傷機(jī)制中發(fā)揮著重要角色，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ的活性，減少ATP的合成，損傷線粒體 DNA［26］。線粒體對(duì)膿毒癥的發(fā)生有重要作用，使得線粒體成為新的膿毒癥治療靶點(diǎn)。

Lowes等［26］的研究表明，LPS/PepG 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型肝臟線粒體呼吸功能會(huì)減弱，在給予LPS/PepG小鼠一定劑量的MitoQ后，體內(nèi)和體外的研究結(jié)果均顯示IL-6的水平降低，而早期IL-6和IL-10的水平被認(rèn)為是決定膿毒癥嚴(yán)重程度的重要因子。此外，作為研究的最多的線粒體靶向抗氧化劑，MitoQ在膿毒癥模型中有一定治療效果，能同時(shí)發(fā)揮抗氧化和抗炎作用［27］，通過減少活性氧和過氧亞硝酸鹽的形成，維持膿毒癥條件下的線粒體膜電位，減輕線粒體功能障礙［26-27，29］。

3 前景展望

除了對(duì)神經(jīng)退行性疾病、MS、代謝綜合征、缺血再灌注損傷、膿毒癥等疾病能發(fā)揮作用外，MitoQ也同時(shí)發(fā)揮著許多其他生理作用，對(duì)費(fèi)里德賴希共濟(jì)失調(diào)成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激以及AD模型小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性損傷均有一定的保護(hù)作用［13］。MitoQ還可以通過降低白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)在人類THP-1細(xì)胞中的產(chǎn)生抑制線粒體和組織病理學(xué)損傷，顯著改善右旋糖苷硫酸酯鈉誘導(dǎo)的小鼠模型的大腸炎，成為一種有潛力的新型的大腸炎治療方法［30］。另外，在一些臨床研究中，丙肝患者口服40～80 mg/kg的MitoQ對(duì)其肝損傷有一定保護(hù)效應(yīng)［4，9，30］。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以使親脂性TPP復(fù)合物外流，使其攝入到腦和肝的量減少，神經(jīng)保護(hù)作用減弱。因此繞過血腦屏障的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以提高線粒體靶向抗氧化劑、藥效團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦［31］。多個(gè)研究表明，將含500μmol MitoQ的水喂食健康小鼠28周對(duì)體重、骨的組成和生長、食物和脂質(zhì)的消耗均無顯著影響，證明嚙齒動(dòng)物長期食用100 ～500 μmol MitoQ 是安全的［9，24，32］。MitoQ 已經(jīng)被澳大利亞的生物制藥公司發(fā)展成藥物，正在進(jìn)行1期和2期的臨床試驗(yàn)［9］。

除了MitoQ等以三苯基磷陽離子脂質(zhì)體為載體的線粒體靶向藥物，還有一些新的線粒體靶向抗氧化劑出現(xiàn)，如四肽類線粒體靶向抗氧化劑SS-20、SS-31，他們也能以一定機(jī)制靶向聚集在線粒體，發(fā)揮其抗氧化作用［33］。MitoQ作為一種新型的、有潛力的線粒體靶向抗氧化劑，有關(guān)其靶向作用機(jī)制和病理學(xué)作用仍有很多矛盾和不清楚的地方，需要做進(jìn)一步的深入研究。

［1］ Heller A，Brockhoff G，Goepferich A.Targeting drugs to mitochondria［J］.Eur J Pharm Biopharm，2012，82(1):1-18.

［2］ Rodriguez-Cuenca S，CocheméH M，Logan A，et al.Consequences of long-term oral administration of the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ to wild-type mice［J］.Free Radil Bio Med，2010，48(1):161-172.

［3］ Murphy M P.Targeting lipophilic cations to mitochondria［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1777(7):1028-1031.

［4］ Solesio M E，Prime T A，Logan A，et al.The mitochondria-targeted anti-oxidant MitoQ reduces aspects of mitochondrial fission in the 6-OHDA cell model of Parkinson＇s disease［J］.Biochimica Biophys Acta，2013，1832(1):174-182.

［5］ Kumar A，Kaur H，Devi P，et al.Role of coenzyme Q10(CoQ10)in cardiac disease，hypertension and Menierelike syndrome［J］.Pharmacol Ther，2009，124(3):259-268.

［6］ Littarru G P，Tiano L.Bioenergetic and antioxidant properties of coenzyme Q10:recent developments［J］.Mol Biotechnol，2007，37(1):31-37.

［7］ Sohal R S，Kamzalov S，Sumien N，et al.Effect of coenzyme Q10intake on endogenous coenzyme Q content，mitochondrial electron transport chain，antioxidative defenses，and life span of mice［J］.Free Radic Biol Med，2006，40(3):480-487.

［8］ Smith R A J，Murphy M P.Animal and human studies with the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1201:96-103.

［9］ Jin H，Kanthasamy A，Ghosh A，et al.Mitochondria-targeted antioxidants for treatment of Parkinson＇s disease:Preclinical and clinical outcomes［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1842(8):1282-1294.

［10］Smith R A J，Hartley R C，CocheméH M，et al.Mitochondrial pharmacology［J］.Trends in pharmacological sciences，2012，33(6):341-352.

［11］Kelso G F，Porteous C M，Coulter C V，et al.Selective Targeting of a Redox-active Ubiquinone to Mitochondria within Cells antioxidant and antiapoptotic properties［J］.J Biol Chem，2001，276(7):4588-4596.

［12］ Obeso J A，Rodriguez-Oroz M C，Goetz C G，et al.Missing pieces in the Parkinson＇s disease puzzle［J］.Nat Med，2010，16(6):653-661.

［13］ Chaturvedi R K，F(xiàn)lint Beal M.Mitochondrial Diseases of the Brain［J］.Free Radical Biology and Medicine，2013(13):1-29.

［14］ Ghosh A，Chandran K，Kalivendi SV，et al.Neuroprotection by a mitochondria-targeted drug in a Parkinson＇s disease model［J］.Free Radic Biol Med，2010，49(11):1674-1684.

［15］ James A M，Collins Y，Logan A，et al.Mitochondrial oxidative stress and the metabolic syndrome［J］.Trends Endocrinol Metab，2012，23(9):429-434.

［16］ Hutcheson R，Rocic P.The metabolic syndrome，oxidative stress，environment，and cardiovascular disease:the great exploration［J］.Exp Diabetes Res，2012:2012.

［17］Mercer JR，Yu E，F(xiàn)igg N，et al.The mitochondria-targeted antioxidant MitoQdecreases features of the metabolic syndrome in ATM+/-/ApoE-/-mice［J］.Free Radic Biol Med，2012，52(5):841-849.

［18］ Mabalirajan U，Ghosh B.Mitochondrial Dysfunction in Metabolic Syndrome and Asthma［J］.J Allergy(Cairo)，2013:2013.

［19］ Van Horssen J，Witte M E，Ciccarelli O.The role of mitochondria in axonal degeneration and tissue repair in MS［J］.Mult Scler，2012，18(8):1058-1067.

［20］ Haider L，F(xiàn)ischer M T，F(xiàn)rischer J M，et al.Oxidative damage in multiple sclerosis lesions［J］.Brain，2011，134(Pt 7):1914-1924.

［21］ Mao P，Reddy P H.Is multiple sclerosis a mitochondrial disease［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802(1):66-79.

［22］Mao P，Manczak M，Shirendeb U P，et al.MitoQ，a mitochondria-targeted antioxidant，delays disease progression and alleviates pathogenesis in an experimental autoimmune encephalomyelitis mouse model of multiple sclerosis［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1832(12):2322-2331.

［23］ Niki＇I，Merkler D，Sorbara C，et al.A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis［J］.Nature Medicine，2011，17:495-499.

［24］ Adlam V J，Harrison JC，Porteous CM，et al.Targeting an antioxidant to mitochondria decreases cardiac ischemia-reperfusion injury［J］.FASEB J，2005，19(9):1088-1095.

［25］Ondrasik R，Chen Q，Navitsky K，et al.Cardioprotective Effects of Selective Mitochondrial-Targeted Antioxidants in Myocardial Ischemia/Reperfusion(I/R)Injury［EB/OL］.［2014-03-01］.http://digitalcommons.pcom.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1073＆context=research_day.

［26］Lowes D A，Webster N R，Murphy M P，et al.Antioxidants that protect mitochondria reduce interleukin-6 and oxidative stress，improve mitochondrial function，and reduce biochemical markers of organ dysfunction in a rat model of acute sepsis［J］.Br J Anaesth，2013，110(3):472-480.

［27］ Galley H F.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis［J］.Br J Anaesth，2011，107(1):57-64.

［28］Lowes D A，Thottakam B，Webster N R，et al.The mitochondria-targeted antioxidant MitoQ protects against organ damage in a lipopolysaccharide-peptidoglycan model of sepsis［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(11):1559-1565.

［29］ Dare A J，Phillips A R J，Hickey A J R，et al.A systematic review of experimental treatments for mitochondrial dysfunction in sepsis and multiple organ dysfunction syndrome［J］.Free Radic Biol Med，2009，47(11):1517-1525.

［30］ Dashdorj A，Jyothi K R，Lim S，et al.Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates experimental mouse colitis by suppressing NLRP3 inflammasome-mediated inflammatory cytokines［J］.BMC Med，2013，6:11.

［31］Porteous C M，Menon D K，Aigbirhio F，et al.P-glycoprotein(Mdr1a/b)and Breast Cancer Resistance Protein(BCRP)decrease the uptake of hydrophobic alkyl triphenylphosphonium cations by the brain［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1830(6):3458-3465.

［32］Wani W Y，Gudup S，Sunkaria A，et al.Protective efficacy of mitochondrial targeted antioxidant MitoQ against dichlorvos induced oxidative stress and cell death in rat brain［J］.Neuropharmacology，2011，61(8):1193-1201.

［33］Reddy P H，Tripathi R，Troung Q，et al.Abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration as early events in Alzheimer＇s disease:implications to mitochondria-targeted antioxidant therapeutics［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822(5):639-649.