沈愛(ài)平

(黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)院，湖北黃岡438002)

色譜法 (chromatography)是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法，是將混合物中各組分分離后在線或離線分析的方法，是現(xiàn)代分離分析的一個(gè)重要方法。1901年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特首先認(rèn)識(shí)到色譜法在分離分析方面的重要價(jià)值，并于1903年首先應(yīng)用色譜法分離植物葉片中的各種色素。色譜法利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對(duì)移動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配，原來(lái)微小的分配差異產(chǎn)生了很明顯的分離效果，從而依先后順序流出色譜柱，通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段對(duì)分離后的各組分進(jìn)行測(cè)定。色譜法具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是分析混合物的最有效手段。色譜法被廣泛用于藥品的鑒別、純度檢查和含量測(cè)定。

藥物分析則是分析化學(xué)在藥物研發(fā)領(lǐng)域中的應(yīng)用分支。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，沒(méi)有藥物分析就沒(méi)有新藥的發(fā)現(xiàn)［1］。該學(xué)科涉及的研究范圍包括藥物質(zhì)量控制、臨床藥學(xué)、中藥與天然藥物分析、藥物代謝分析、法醫(yī)毒物分析、興奮劑檢測(cè)和藥物制劑分析、創(chuàng)新藥物研究，以及藥品上市后的評(píng)價(jià)等［2］。

1 薄層色譜法(Thin layer chromatography，TLC)

薄層色譜法(Thin layer chromatography，TLC)是將供試品溶液點(diǎn)樣于涂布有固定相的薄層板上，經(jīng)展開(kāi)、檢視后所得的譜圖，與適宜的對(duì)照品按同法操作所得的色譜圖進(jìn)行比較，主要用于藥品的鑒別及藥品中雜質(zhì)的檢測(cè)［3］。薄層色譜法操作方便，分離效率高，專屬性好，分析速度快，各國(guó)藥典中均有多種藥物采用TLC法來(lái)檢查有關(guān)物質(zhì)以保證藥品的純度。近年來(lái)，盡管其他色譜技術(shù)發(fā)展迅速，但薄層色譜的應(yīng)用并沒(méi)有明顯減少［4］。

薄層色譜法可根據(jù)藥物中雜質(zhì)的不同情況，可采用不同的方法進(jìn)行檢查［5］:若雜質(zhì)已知，則可采用雜質(zhì)對(duì)照品法進(jìn)行檢查;若雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)不能確定或無(wú)雜質(zhì)的對(duì)照品，則可采用高低濃度對(duì)比法。畢雪艷［6］等采用薄層色譜法檢測(cè)復(fù)方氨酚烷胺顆粒中有關(guān)物質(zhì)(對(duì)氯苯乙酰胺)，以硅膠 GF254為固定相，以0.5% 的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑，展開(kāi)劑為氯仿－丙酮－甲苯(13∶5∶2)。該法測(cè)得的對(duì)氯苯乙酰胺最小檢出量為0.2 μg。張尊聽(tīng)等［7］建立了新型內(nèi)標(biāo)法以大豆甙元為內(nèi)標(biāo)物測(cè)定葛根素注射液、中藥葛根及中成藥玉泉丸中葛根素的含量，試驗(yàn)以甲醇－乙酸乙酯－石油醚－水(1.8∶6.0 ∶4.0 ∶0.35)為展開(kāi)劑，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，平均回收率為98.99%，RSD小于1.78%。

薄層色譜法優(yōu)點(diǎn):1.展開(kāi)時(shí)間短，一般十至幾十分鐘。2.分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中。3.靈敏度高，通常幾至幾十微克的物質(zhì)即可被檢出。4.顯色方便，可直接噴灑腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸等。5.所用儀器簡(jiǎn)單，操作方便，可以普及。6.薄層板價(jià)格低廉，一塊板可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。7.色譜直觀性強(qiáng)。具有操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，分離效率高，專屬性好，分析速度快，色譜參數(shù)易調(diào)整等特點(diǎn)，在藥物分析中應(yīng)用較為廣泛。

2 氣相色譜法(Gas chromatatography，GC)

氣相色譜法(Gas chromatatography，GC)是1952年創(chuàng)立的一種以氣體為流動(dòng)相的柱色譜法，是采用氣體流動(dòng)相(載氣)流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。由于氣體粘度小，組分?jǐn)U散速率高，傳質(zhì)快，采用高靈敏度的通用型檢測(cè)器，使得氣相色譜法具有選擇性好、柱效高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等特點(diǎn)，但受樣品蒸汽壓限制，不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)的分析。

李成等［8］建立氣相色譜法測(cè)定復(fù)方達(dá)克羅寧薄荷腦潤(rùn)膚止癢水中薄荷腦含量，薄荷腦質(zhì)量濃度線性范圍為 0.3356 － 1.678 g/L。賀煥華等［9］建立的毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定鹽酸頭孢吡肟中N－甲基吡咯烷雜質(zhì)含量，N－甲基吡咯烷濃度在1.1213－134.56 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.99998，RSD=0.00486%，加樣回收率 101.73%，檢測(cè)限 0.6 ng。劉敏等［10］采用 DB －17(30 m×0.53 mm，1μm)毛細(xì)管色譜柱建立毛細(xì)管氣相色譜法直接測(cè)定撲米酮片中撲米酮的含量，撲米酮在0.096～4.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，平均回收率為 98.7%。

氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)是:1.應(yīng)用范圍廣，能分析氣體、液體和固體。2.靈敏度高:可測(cè)定痕量物質(zhì)，進(jìn)樣量可在1mg以下，一般氣體樣量為幾毫升，液體樣用幾微升或幾十微升?？勺鞒儦怏w、高分子單體的痕跡量雜質(zhì)分析和空氣中微量毒物的分析。3.選擇性高:可有效地分離性質(zhì)極為相近的各種同分異構(gòu)體和各種同位素。4.效能高:可把組分復(fù)雜的樣品分離成單組分。5.速度快:一般分析，只需幾分鐘即可完成，有利于指導(dǎo)和控制生產(chǎn)。6.應(yīng)用范圍廣:即可分析低含量的氣、液體，亦可分析高含量的氣、液體，可不受組分含量的限制。

3 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)高效液相色譜是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種在線分離分析方法，采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高，選擇性好和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。它結(jié)合了液相色譜法和氣相色譜法的分析分離原理，并且可以直接用于分析難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子樣品，彌補(bǔ)了氣相色譜法的弱點(diǎn)，擴(kuò)大了色譜法的應(yīng)用范圍。由于HPLC方法的諸多優(yōu)點(diǎn)，使得該方法稱為中國(guó)藥典所有分析方法中發(fā)展最快的一種分析方法。由1985年版剛規(guī)定使用時(shí)的8個(gè)品種，發(fā)展到2000版藥典的282個(gè)品種。高效液相色譜法包括吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法和分子排阻色譜法，其中基于分配機(jī)理的高效液相色譜法在藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛的一種儀器分析方法。

朱莉萍等［11］建立高效液相色譜－熒光法(HPLC－FLD)檢測(cè)豬肉中兩種氟喹諾酮類藥物，采用 ZORBAX－SB－C18 色譜柱，以乙腈、0.01 mol/L磷酸二氫鈉(磷酸調(diào) pH 3)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。本方法測(cè)定動(dòng)物組織中的恩諾沙星、環(huán)丙沙星的殘留，檢測(cè)條件穩(wěn)定，加標(biāo)回收率高，系數(shù)較小，可操作性強(qiáng)，應(yīng)用簡(jiǎn)單方便。林祖武［12］建立了HPLC法測(cè)定苦參洗劑中苦參堿含量，苦參堿的進(jìn)樣量在0.12－2 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，平均回收率為98.03%，RSD為 1.36%，方法簡(jiǎn)便可行準(zhǔn)確，且可操作性好。趙軍等［13］建立了反相高效液相色譜法同時(shí)分離測(cè)定6種臨床最常用的頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢噻肟)，采用 SHIM－PACK VP－ODS(150×4.6mm I.D.)色譜柱，以乙腈及 0.05 mol/L HAC－NaAC緩沖溶液(pH=4.0)組成流動(dòng)相梯度淋洗，在 15 min內(nèi)分離并測(cè)定了上述6種頭孢菌素，6種藥物最低檢出限均可達(dá)到 0.20 μg/mL。

高效液相色譜法主要優(yōu)點(diǎn)是:1.分辨率高于其它色譜法。2.速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成。3.重復(fù)性高。4.高效相色譜柱可反復(fù)使用。5.自動(dòng)化操作，分析精確度高。

4 色譜聯(lián)用技術(shù)

4.1 色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

色譜－質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合了色譜高分離能力和質(zhì)譜高靈敏度、極強(qiáng)的定性專屬特異性于一體，使樣品的分離、定性及定量成為連續(xù)的過(guò)程，是一種高效能、高選擇性、高靈敏度的分離分析方法。在藥物分析中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分為氣相色譜－質(zhì)譜法(gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS)和液相色譜－質(zhì)譜法(liquid chromatography－mass spectrometry，LC－MS)。GCMS對(duì)可揮發(fā)性未知成分與微量成分的結(jié)構(gòu)分析具有明顯優(yōu)勢(shì)。但是由于GC法的局限性，使得GCMS難以用于極性、熱不穩(wěn)定和大分子化合物的測(cè)定。陳琴華等［14］不僅分析了 GC－MS靈敏度的影響因素，還通過(guò)大量的文獻(xiàn)總結(jié)了 GC－MS在體內(nèi)化學(xué)藥物分析、濫用藥物分析及興奮劑檢測(cè)中的應(yīng)用。

朱全紅等［15］建立 GC－MS測(cè)定6名健康志愿者單次口服麻黃湯后尿液中麻黃堿類代謝產(chǎn)物的濃度，去甲偽麻黃堿(NMP)、去甲麻黃堿(NME)、麻黃堿(E)、偽麻黃堿(PE)和甲基麻黃堿(ME)在24h內(nèi)達(dá)到良好分離，5種麻黃生物堿的回收率均在88.74%－102.70%之間，日內(nèi)和日間精密度均≤10%。陳吉漢等［16］建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC－MS)測(cè)定雞肉與雞蛋中6種他汀類藥物殘留量。色譜柱為 BEH C18，以甲醇－0.1%甲酸5mmol乙酸銨為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，6 種他汀類藥物在 1.0－100 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，r＞0.9910，檢出限和定量限分別為 0.1－0.5 μg/kg 和 0.3－2.0 μg/kg。實(shí)際上，聯(lián)用技術(shù)還帶來(lái)許多無(wú)形的利益，包括減低成本?，F(xiàn)代GC/MS的分離度和分析速度、靈敏度、專屬性和通用性，至今仍是其他聯(lián)用技術(shù)難以達(dá)到的。因此，只要待測(cè)成分適用于GC分離，GC/MS就成為聯(lián)用技術(shù)中首選的分析方法。

4.2 色譜－核磁共振波譜聯(lián)用

液相色譜－核磁共振聯(lián)用(LC－NMR)出現(xiàn)于1978年，是快速分離、確定結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力的藥物分析手段?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于有機(jī)小分子藥物的鑒別定量，生物大分子類生化藥物的結(jié)構(gòu)研究、藥物的體外評(píng)價(jià)與研究及體內(nèi)藥物的監(jiān)控與研究等。

王映紅等［17］用停止流動(dòng)的方法，對(duì)混合物的各個(gè)組分進(jìn)行分離，并獲得1H NMR及COSY譜，建立了用高效液相－核磁共振聯(lián)用技術(shù)(HPLCNMR)檢測(cè)微量級(jí)蛇葡萄根提取物中混合組分結(jié)構(gòu)的方法，通過(guò)與此類化合物所建立的氫譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，確定了微克級(jí)的天然產(chǎn)物混合物中的主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)，使微量天然混合物中的主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)得到證實(shí)，充分體現(xiàn)了HPLC－NMR技術(shù)的微量、快速的特點(diǎn)。楊春等［18］用高效液相色譜－核磁共振(HPLC－NMR)聯(lián)用技術(shù)中的連續(xù)流動(dòng)和停止流動(dòng)兩種模式對(duì)萘哌地爾中雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，將萘哌地爾樣品用乙腈溶解為濃度5 g/L。高效液相色譜的分析柱采用 Inertsil ODS－3 柱(4.6 I.D.×250 mm，5μm)。連續(xù)流動(dòng)的進(jìn)樣量為20μL，停止流動(dòng)的進(jìn)樣量為 50μL。檢測(cè)器為 Varian Prostar－330二極管陣列檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。HPLC分離條件為乙腈 ∶磷酸緩沖溶液=65∶35(pH7.8－8.0)。所有的圖譜均在 INOVA－500核磁共振儀上完成。根據(jù)1HNMR，1H－1HCOSY譜完成了主要雜質(zhì)1－萘環(huán)－丙三醇結(jié)構(gòu)鑒定。

LC－NMR的特點(diǎn)不僅是LC的高效分離能力和NMR精確的結(jié)構(gòu)分析能力，更體現(xiàn)在兩者的有機(jī)結(jié)合。特別是當(dāng)前超低溫探頭技術(shù)、微探頭技術(shù)、流動(dòng)抑制技術(shù)使LC－NMR的應(yīng)用在藥物分析中更加深入廣泛。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著技術(shù)水平和新型儀器水平的不斷提高，色譜法成為各國(guó)藥典中發(fā)展較快的藥物分析方法。在藥物質(zhì)量控制、天然藥物及中成藥分析、生物制品分析、藥物代謝分析、藥物制劑分析等諸多領(lǐng)域里，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)待測(cè)樣品的性質(zhì)、檢測(cè)要求等可采取不同的色譜法:如薄層色譜法，主要用于有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)以保證藥品的純度。氣相色譜因待測(cè)物質(zhì)需要?dú)饣?，因此適用于易揮發(fā)、對(duì)熱穩(wěn)定的樣品。高效液相色譜法對(duì)樣品要求較低、選擇性好、靈敏度高，其檢出限低。因此，它是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的藥物分析方法。

目前各學(xué)科間各種技術(shù)的相互滲透，不斷涌現(xiàn)出各種新穎的色譜方法，并朝著微量化、自動(dòng)化、聯(lián)用化方向發(fā)展，尤其是色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，更加拓展了色譜法的深度，更加擴(kuò)大了色譜法的檢測(cè)范圍，因而在醫(yī)藥研究領(lǐng)域里，其使用范圍將更加廣泛，也更具有現(xiàn)代科學(xué)意義。

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