楊 蕾，閆 紅，董國鳳，何 莉

0 引言

蟾蜍靈(Bufalin)是一種由中華大蟾蜍(Bufo gargarizans cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus schneider)的耳后腺或皮脂腺所分泌的白色漿液，經(jīng)擠取、干燥、加工而成的中藥制劑，在惡性腫瘤治療中有廣闊的應用前景[1]。蟾蜍靈有誘導白血病細胞凋亡及分化的作用[2]。蟾蜍靈以時間、劑量依賴方式抑制急性淋巴細胞白血病CEM細胞增殖、誘導凋亡[3]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能將細胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)及細胞核內(nèi)，通過保守的三級級聯(lián)反應(MAPKKK-MAPKK-MAPK)激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達及細胞的增殖、分化和凋亡[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路在白血病細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[5-7]，但蟾蜍靈通過MAPK通路誘導Jurkat細胞凋亡的研究還很少。本實驗以Jurkat細胞為模型，觀察ERK阻滯劑PD98059、JNK阻滯劑SP600125、p38MAPK阻滯劑SB203580在蟾蜍靈抑制急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞增殖及誘導其凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞株，由中國醫(yī)科大學中心實驗室保存；蟾蜍靈購于Sigma公司，用無水乙醇配成1 mmol/L原液，-20 ℃貯存，實驗前用PBS稀釋，將乙醇終濃度控制在體積分數(shù)<0.01%，預實驗表明，該濃度乙醇對細胞增殖沒有影響；WST-1、PD98059、SP600125 及SB203580購自碧云天公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將Jurkat細胞株置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。臺盼藍染色，拒染率大于95%為對數(shù)生長期細胞，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 WST-1法檢測細胞增殖 實驗分為單用5、10、20、40、80 nmol/L蟾蜍靈組；單用PD98059、SP600125、SB203580組；10 μmol/L PD98059、20 μmol/L SP600125、10 μmol/L SB203580分別預處理1 h后用20 nmol/L蟾蜍靈繼續(xù)作用組，并設立陰性對照(未加藥孔)及空白對照(無細胞孔)，每個樣本設3個復孔。抑制率(%)=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/對照組平均A值×100%。抑制細胞增殖50%的藥物濃度(IC50)采用回歸法計算。實驗重復3次取平均值。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 實驗分為單用20 nmol/L蟾蜍靈、10 μmol/L PD98059+20 nmol/L蟾蜍靈、20 μmol/L SP600125+20 nmol/L蟾蜍靈、10 μmol/LSB203580+20 nmol/L蟾蜍靈組，進行流式細胞術(shù)檢測。實驗重復3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 蟾蜍靈、PD98059、SP600125、SB203580單用及聯(lián)合應用對Jurkat細胞增殖的影響

2.1.1 蟾蜍靈對Jurkat細胞增殖的抑制作用 5、10、20、40、80 nmol/L蟾蜍靈分別處理Jurkat細胞48 h，抑制率分別為13.42%±2.1%、25.05%±2.3%、30.42%±4.0%、37.18%±3.7%、41.35%±7.5%，蟾蜍靈對Jurkat細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)，結(jié)果見表1。蟾蜍靈作用于Jurkat細胞48 h的IC50為44 nmol/L。

2.1.2 PD98059、SP600125、SB203580對Jurkat細胞增殖的抑制作用 10 μmol/L PD98059、20 μmol/L SP600125、10 μmol/L SB203580 分別處理Jurkat細胞48 h，對細胞增殖的抑制率分別為5.34%、6.54%和3.32%，不同濃度阻滯劑對細胞增殖無影響(P>0.05)。

表1 不同濃度蟾蜍靈對Jurkat細胞的抑制率

2.1.3 蟾蜍靈聯(lián)合PD98059、SP600125、SB203580對Jurkat細胞增殖的抑制作用 10 μmol/L PD98059和20 μmol/L SP600125分別與20 nmol/L蟾蜍靈聯(lián)合作用 Jurkat細胞48 h，其抑制率分別為49.14%±0.82%和47.05%±0.31%；與單用蟾蜍靈組相比細胞抑制率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。10 μmol/L SB203580與20 nmol/L蟾蜍靈聯(lián)合作用Jurkat細胞的抑制率為25.38%±0.62%，抑制率減低，與單用蟾蜍靈組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

2.2 蟾蜍靈單用或聯(lián)合PD98059、SP600125、SB203580對Jurkat細胞凋亡的影響 20 nmol/L蟾蜍靈作用Jurkat細胞48 h，細胞凋亡率為9.86%±0.14%。預先用10 μmol/L PD98059、20 μmol/L SP600125、10 μmol/L SB203580分別處理Jurkat細胞1 h后加入20 nmol/L蟾蜍靈繼續(xù)作用48 h，細胞凋亡率分別為14.57%±0.26%、13.52%±0.43%和9.72%±0.05%。10 μmol/L PD98059和20 μmol/L SP600125分別與20 nmol/L蟾蜍靈聯(lián)合作用，Jurkat細胞的凋亡率顯著增加，與單用蟾蜍靈相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。10 μmol/L SB203580與20 nmol/L蟾蜍靈聯(lián)合作用，Jurkat細胞的凋亡率無明顯改變(P>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 蟾蜍靈聯(lián)合阻滯劑對Jurkat細胞的抑制率和凋亡率

3 討論

蟾蜍靈對髓系白血病細胞有抑制增殖和誘導凋亡作用[2]。蟾蜍靈處理白血病細胞HL-60、ML-1、U937細胞后，可觀察到細胞皺縮，凋亡小體及染色質(zhì)碎裂凝集等凋亡形態(tài)學改變[8]。本實驗室曾系統(tǒng)研究過蟾蜍靈對髓系白血病細胞HL-60、K562、NB4等細胞及急性淋巴白血病CEM細胞的作用，發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈可誘導白血病細胞凋亡，從而發(fā)揮其抗癌作用，并證實在蟾蜍靈誘導白血病細胞凋亡過程中，同時上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因和蛋白的表達，如WT-l、Bcl-2、Survivin、BAX和Smac等[9-13]。另有實驗表明，通過應用caspase阻斷劑，發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈通過內(nèi)源性凋亡通路誘導人淋巴細胞白血病Jurkat細胞凋亡[14]。以上多以髓系白血病細胞為主，蟾蜍靈是否通過MAPK通路誘導Jurkat細胞凋亡目前尚無文獻報道，本研究將蟾蜍靈作用于急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞，實驗結(jié)果表明，相同時間內(nèi)隨著蟾蜍靈濃度增加，OD值逐漸減少，說明蟾蜍靈能抑制白血病Jurkat細胞增殖，而且呈劑量依賴性，蟾蜍靈可誘導白血病Jurkat細胞凋亡。

MAPK是細胞內(nèi)廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種細胞反應的調(diào)節(jié)，如細胞增殖、分化、凋亡及細胞周期調(diào)控等[15]。每條信號通路都具有高度特異性，具有獨立的功能。MAPKs家族主要通路包括：胞外信號調(diào)控激酶1/2通路(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶通路(JNK1/2)、P38絲裂原活化蛋白酶通路(P38)和ERK5通路，4條通路由獨立的(有時重疊)信號級聯(lián)激活。另外，還包括ERK3/4、ERK7/8和NLK通路等同樣具有明顯的調(diào)節(jié)功能。MAPK信號通路在白血病細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

ERK1/2通路主要調(diào)節(jié)細胞生長、生存，在一定條件下也可促進細胞的誘導分化。ERK1/2通路阻滯劑U0126和PD98059干擾ERK1/2通路，可協(xié)同化療藥物促進白血病細胞凋亡。研究表明，U0126和PD98059干擾ERK1/2通路，可增強2-氯-2′-脫氧腺苷對B系慢性淋巴白血病EHEB細胞的毒性作用[16]；PD98059阻斷ERK1/2通路，可誘導慢性髓系白血病HL-60細胞凋亡，同時活化caspase-3[17]。PD98059協(xié)同蟾蜍靈誘導K562細胞凋亡，下調(diào)bcl-2蛋白表達[18]。本實驗結(jié)果表明，PD98059和蟾蜍靈聯(lián)合作用于Jurkat細胞，其增殖抑制率和凋亡率分別為49.14%±0.82%、14.57%±0.26%，與單獨應用蟾蜍靈相比，對Jurkat細胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義。表明PD98059干擾ERK1/2通路可協(xié)同蟾蜍靈抑制Jurkat細胞增殖、誘導其凋亡。

JNK1/2通路多在應激條件下激活，主要介導前凋亡信號、生長抑制信號和炎性反應，JNK1/2通路阻滯劑SP600125可阻斷JNK1/2通路。Torres等[19]指出，SP600125可顯著誘導白血病細胞凋亡，下調(diào)IL-18的表達，從而誘導ULBP2蛋白表達水平，且呈劑量依賴性。本實驗結(jié)果表明，SP600125和蟾蜍靈聯(lián)合作用于Jurkat細胞，其增殖抑制率和凋亡率分別為47.05%±0.31%、13.52%±0.43%，與單獨應用蟾蜍靈組相比，對Jurkat細胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增加，其差異均有統(tǒng)計學意義。表明SP600125干擾JNK1/2通路可協(xié)同蟾蜍靈抑制Jurkat細胞增殖、誘導其凋亡。

p38通路同JNK1/2通路一樣多在應激條件下激活，在一定條件下，p38通路也可誘導抗細胞凋亡、促進細胞增生和細胞生存信號，這有賴于所涉及的組織和參與的p38亞型。Hirosawa等[20]發(fā)現(xiàn)，p38MAPK阻滯劑SB202190可促進急性單核細胞白血病THP-1及MV4-11細胞生長，同時增加磷酸化C-Raf表達。Chen等[21]應用高壓氧處理急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞，表現(xiàn)出顯著的細胞凋亡，細胞內(nèi)p38磷酸化水平顯著上調(diào)。本實驗結(jié)果提示，SB203580 聯(lián)合蟾蜍靈作用于Jurkat細胞，與單獨應用蟾蜍靈組比較，可顯著抑制細胞增殖，但對其凋亡無影響。

本實驗對蟾蜍靈通過MAPK通路誘導Jurkat細胞凋亡進行初步探討，結(jié)果表明，MAPK信號通路與蟾蜍靈抑制急性淋巴細胞白血病Jurkat 細胞增殖及誘導其凋亡有相關(guān)性。表現(xiàn)為ERK和JNK通路促進增殖、抑制細胞凋亡；p38MAPK抑制增殖，但對凋亡無明顯影響。

參考文獻：

[1] Yin PH,Liu X,Qiu YY,et al.Anti-tumor activity and apoptosis-regulation mechanisms of bufalin in various cancers:new hope for cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5339-5343.

[2] Kurosawa M,Tani Y,Nishimura S,et al.Distinct PKC isozymes regulate bufalin-induced differentiation and apoptosis in human monocytic cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2001,280(3):C459-C464.

[3] 何莉,荊薇,劉云鵬,等.蟾蜍靈誘導人急性淋巴白血病細胞凋亡的實驗研究[J]．中國醫(yī)科大學學報,2008,37(5):638-640.

[4] Cargnello M,Roux PP.Activation and Function of the MAPKs and Their Substrates,the MAPK-Activated protein Kinases [J].Microbiol Mol Biol Rev,2011,75(1):50-83.

[5] Witt O,Sand K,Pekrun A.Butyrate-induced erythroid differentiation of human K562 leukemia cells involves inhibition of ERK and activation of p38MAP kinase pathways[J].Blood,2000,95(7):2391-2396.

[6] Yen A,Cherington V,Schaffhausen B,et al.Transformation-defective polyoma middle T antigen mutants defective in PLCC,P I-3,or src kinase activation enhance ERK2 activation and promote retinoic acid-induced,cell differentiation like wild-type middle T[J].Exp Cell Res,1999,248(2):538-551.

[7] Wang X,Rao J,Studzinski GP.Inhibition of p38MAP kinase activity up-regulates multiple MAP kinase pathways and potentiates 1,25-dihydroxyvitamin D(3)-induced differentiation of human leukemia HL60 cells [J].Exp Cell Res,2000,258(2):425-437.

[8] Jing Y,Watabe M,Hashimoto S,et al.Cell cycle arrest and protein kinase modulating effect of bufalin on human leukemia ML-1 cells[J].Anticancer Res,1994,14(3A):1193-1198.

[9] 朱志圖,金波,劉云鸝,等.蟾蜍靈增強全反式維甲酸對急性早幼粒細胞白血病原代培養(yǎng)細胞的誘導分化[J].中華內(nèi)科雜志,2006,45(4):314-317.

[10]田昕,王萍萍,劉云鵬,等.蟾蜍靈在誘導HL-60細胞凋亡過程中對Bcl-2和PKC的影響[J].中國實驗血液學雜志,2007,15(1):67-71.

[11]劉云鵬,曲秀娟,王萍萍,等.蟾蜍靈誘導K562細胞分化和凋亡過程中WT1表達的下調(diào)[J].中華血液學雜志,2002,23(7):356-359.

[12]王甦,劉云鵬.候科佐,等.蟾蜍靈在誘導K562細胞凋亡過程中下調(diào)TOPO-Ⅱα蛋白表達[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(22):170l-1703.

[13]Zhu Z,Li E,Gao Y,et al.Bufalin induces the apoptosis of acute promyelocytic leukemia cells via the downregulation of survivin expression[J].Acta Haematol,2012,128(3):144-150.

[14]Shiratsuchi A,Nakanishi Y.Phosphatidylserine-mediated phagocytosis of anticancer drug-treated cells by macrophages [J].J Biochem,1999,126(6):1101-1106.

[15]Johnson GL,Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK,JNK and p38 protein kinases[J].Science,2002,298(5600):1911-1912.

[16]Smal C,Lisart S,Maerevoet M,et al.Pharmacological inhibition of the MAPK/ERK pathway increases sensitivity to 2-chloro-2′-deoxyadenosine(CdA)in the B-cell leukemia cell line EHEB[J].Biochem Pharmacol,2007,73(3):351-358.

[17]Zhou L,Luan H,Dong X,et al.Activation of the PI3K/Akt and MAPK signaling pathways antagonizes adriamycin-induced HL-60 leukemia cell apoptosis[J].Mol Med Report,2010,3(4):641-644.

[18]王甦,張曉晶,劉云鵬,等.細胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑協(xié)同蟾蜍靈誘導K562細胞凋亡[J].第三軍醫(yī)大學學報,2007,29(05):393-395.

[19]Torres F,Quintana J,Diaz JG,et al.Trifolin acetate-induced cell death in human leukemia cells is dependent on caspase-6 and activates the MAPK pathway[J].Apoptosis,2008,13(5):716-728.

[20]Hirosawa M,Nakahara M,Otosaka R,et al.The p38 pathway inhibitor SB202190 activates MEK/MAPK to stimulate the growth of leukemia cells[J].Leukemia Research,2009,33(5):693-699.

[21]Chen YC,Chen SY,Ho PS,et al.Apoptosis of T-leukemia and B-myeloma cancer cells induced by hyperbaric oxygen increased phosphorylation of p38 MAPK[J].Leuk Res,2007,31(6):805-815.