徐紅欣，管立，回鵬，陳秋玲

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

茵陳為菊科植物濱蒿(ArtemisiascopariaWaldst Et Kit)或茵陳蒿(ArtemisiacapillariesThunb)的干燥地上部分.苦、辛、微寒，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)，清濕熱，退黃疸，常用于黃疸尿少、濕瘡瘙癢、傳染性黃疸型肝炎等.其含有香豆素、黃酮、色原酮、有機(jī)酸、烯炔、三萜、甾體、多糖和醛酮等多類化學(xué)成分，其多糖主要含有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、半乳糖及果糖等組分[1-2].茵陳多糖具有抑菌[1,3]、護(hù)肝、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫平衡[4-7]、抗鼻咽癌[8]、抑制幽門(mén)螺旋桿菌對(duì)胃癌上皮細(xì)胞的粘附[9]等多方面的藥理作用.目前對(duì)茵陳多糖提取工藝的研究基本上還是空白，本文利用單因素和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了茵陳多糖的提取工藝，得到的優(yōu)化工藝條件為：提取溫度100 ℃，提取時(shí)間80 min，提取液(mL)固(g)比50∶1,提取1次.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次，平均得率為2.25%，與預(yù)測(cè)值2.26%相比，誤差僅為0.44%.

1 儀器與試劑

FA2104N型電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；80-2離心機(jī)(上海榮泰生化工程有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；GZX-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DZF-6050真空干燥箱(鞏義市予華儀器責(zé)任有限責(zé)任公司)；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(保定市新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠)；BCD-223MT冰箱(河南新飛電器有限公司)；722可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；移液槍(上海佳安分析儀器廠)；95%乙醇(分析純，天津市美琳工貿(mào)有限公司)；苯酚(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠).蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)；茵陳(河北省安國(guó)藥材市場(chǎng))，經(jīng)筆者鑒定為茵陳蒿ArtemisiacapillariesThunb 的干燥地上部分.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 茵陳多糖的提取工藝流程

將茵陳蒿在70 ℃真空干燥3 h后，粉碎，過(guò)篩，精確稱取2.5 g于250 mL茄型瓶中，加入規(guī)定液固比的蒸餾水，在選擇的水浴溫度加熱回流規(guī)定時(shí)間，過(guò)濾，將濾液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約10 mL，加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇30 mL，置具塞錐形瓶中，放置冰箱4 ℃過(guò)夜，然后離心棄去上清液，取沉淀，于50 ℃真空干燥，精密稱重.

2.2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

在單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，依次改變提取液固比、提取溫度、提取時(shí)間，以純多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上確定均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1.

2.3 苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

儲(chǔ)備液的制備：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖0.125 9 g，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，搖勻得125.9 mg/L的儲(chǔ)備液.

標(biāo)準(zhǔn)液的制備：分別精密量取儲(chǔ)備液1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mL，置于25 mL的容量瓶中定容，則得5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液.

50 g/L苯酚溶液的制備：取苯酚100 g，加入鋁片0.2 g，碳酸氫鈉0.2 g，蒸餾，收集(180±2) ℃餾分，稱取餾分1.2512 g于燒杯中，用約50 ℃的蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL棕色容量瓶中定容，置于冰箱中備用.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別移取2 mL各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，快速加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，充分混勻，再移取5 mL濃硫酸快速加入其中，蓋好試管塞，充分搖勻.沸水浴15 min，冷水浴10 min，室溫放置5 min.以蒸餾水為空白對(duì)照，分別在490 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程：A=0.014 6c+0.074，相關(guān)系數(shù)：r2=0.999 2，線性為：10.072～50.360 mg/L.

2.3.2 茵陳多糖含量的測(cè)定

精密稱取實(shí)驗(yàn)所得粗多糖約0.010 0 g于小燒杯中，加少量蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓D(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中定容，得茵陳多糖供試品溶液.移取2 mL供試品溶液于具塞試管中，加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，充分混勻，再加入5 mL濃硫酸，充分混勻.沸水浴15 min，冷水浴10 min，室溫放置5 min，在490 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白對(duì)照.依標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖濃度及產(chǎn)率.

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取液固比對(duì)茵陳多糖產(chǎn)率的影響

采用提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2.5 h，提取1次，考察了液固比對(duì)多糖產(chǎn)率的影響.考察液固比依次為40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，多糖產(chǎn)率分別為1.56%，1.70%，1.44%，1.41%，1.39%，如圖1所示.

圖1表明，液固比在40∶1和50∶1之間純多糖產(chǎn)率共提高8.97%，在50∶1到60∶1之間，反而大幅度下降15.29%，在60∶1與80∶1之間仍呈下降趨勢(shì)，但下降趨勢(shì)已不明顯.判斷液固比到達(dá)50∶1之后，多糖成分已基本溶出，所以液固比50∶1左右最為合適.

3.1.2 提取溫度對(duì)茵陳多糖產(chǎn)率的影響

采用提取液固比為40∶1，提取時(shí)間2.5 h，提取1次，考察了提取溫度對(duì)多糖產(chǎn)率的影響.考察溫度為60，70，80，90，100 ℃，多糖產(chǎn)率分別為1.05%，1.13%，1.46%，1.61%，2.30%，如圖2所示.

圖1 提取液固比對(duì)茵陳多糖產(chǎn)率的影響 Fig.1 effect of liquid-solid ratio on Artemisia capillaris polysaccharides yield

圖2 提取溫度對(duì)茵陳多糖產(chǎn)率的影響 Fig.2 effect of extracting temperature on Artemisia capillaris polysaccharides yield

由圖2可以看出，隨著溫度的上升，純多糖產(chǎn)率呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明溫度的提高對(duì)多糖的溶出有幫助，得出多糖的最佳提取溫度為100 ℃.

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)茵陳多糖產(chǎn)率的影響

采用提取溫度80 ℃，提取液固比40∶1，提取1次，考察了提取時(shí)間對(duì)純多糖產(chǎn)率的影響.考察時(shí)間分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，多糖產(chǎn)率相應(yīng)依次為1.57%，1.73%，1.62%，1.56%，1.50%.如圖3所示.

圖3 提取時(shí)間對(duì)茵陳多糖產(chǎn)率的影響 Fig.3 Effect of extraction time on Artemisia capillaris polysaccharides yield

由圖3可以看出，提取時(shí)間超過(guò)1.5 h后多糖產(chǎn)率并未繼續(xù)增加，反而下降；而1.5 h之前，多糖產(chǎn)率呈增加趨勢(shì)且1.5 h時(shí)達(dá)到最高，故1.5 h左右為最佳提取時(shí)間.

3.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)之前單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了溫度、液固比和時(shí)間這3個(gè)因素的取值范圍：提取溫度X1∶55～100 ℃；液固比X2∶30∶1～75∶1；提取時(shí)間X3∶50 ～140 min.所設(shè)計(jì)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案U10(103)及結(jié)果Tab.1 Uniform design experimental program U10 (103) and results

用SPSS 19.0以純多糖得率為因變量，以提取溫度、提取液固比、提取時(shí)間為自變量進(jìn)行回歸分析，得回歸方程如表2所示.

表2 回歸方程列表Tab.2 Regression equation list

表2中，Y為純多糖產(chǎn)率，X1為提取溫度，X2為提取液固比(取其倍數(shù)值用于回歸)，X3為提取時(shí)間.方程1為X1，X2，X3及其所有交叉作用項(xiàng)采用逐步回歸分析所得；方程2為X1,X2,X3以進(jìn)入方式回歸所得.在模型匯總中，方程1調(diào)整R2=0.983，剩余標(biāo)準(zhǔn)差為0.214 17，P<0.01；方程2調(diào)整R2=0.992，剩余標(biāo)準(zhǔn)差為0.014 833，P<0.01.由調(diào)整R2值及剩余標(biāo)準(zhǔn)差可知兩個(gè)方程均高度有效，方程2優(yōu)于方程1,方程2的最大預(yù)測(cè)值為2.26%，綜合兩個(gè)方程顯示的關(guān)系及前面單因素實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得出優(yōu)化提取條件為提取溫度100 ℃，提取液固比50∶1，提取時(shí)間80 min,提取1次。

3.3 優(yōu)化提取工藝的驗(yàn)證

按上述工藝條件重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果純多糖產(chǎn)率分別為2.20%，2.26%，2.29%，平均值為2.25%，與理論得率2.26%相比，誤差僅為0.44%.

另外，在優(yōu)化工藝條件下，提取3次，純多糖得率分別為2.20%，2.36%，2.39%，平均值為2.32%，與前述提取1次平均值2.25%相比，僅提高3.11%，說(shuō)明在此工藝條件下，提取1次已經(jīng)比較完全，從成本計(jì)，沒(méi)有必要再增加提取次數(shù).

4 結(jié)論

以上實(shí)驗(yàn)得出茵陳多糖的優(yōu)化提取條件為：提取溫度為100 ℃，提取液固比為50∶1，提取時(shí)間為80 min， 提取次數(shù)為1次，純多糖得率可達(dá)2.25%.

均勻設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)條件范圍變化大而需要進(jìn)行多水平實(shí)驗(yàn)的情況下，與正交設(shè)計(jì)相比可極大地減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理采用回歸分析方法，建立了可定量描述指標(biāo)和因素間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)值與理論值十分接近，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)和回歸分析方法得到的實(shí)驗(yàn)參數(shù)較為可靠，為茵陳多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用打下些許基礎(chǔ).

參 考 文 獻(xiàn):

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