葉 婷 綜述，劉靳波審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，是最常見的惡性腫瘤之一，在全球消化系統(tǒng)腫瘤病死率中占第三位，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。肝癌最主要的病因是慢性肝炎病毒感染（HBV和HCV），肝硬化以及營(yíng)養(yǎng)不良因素，毒素侵襲和代謝紊亂等。目前肝癌的診治有了很大進(jìn)步，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。隨著近年的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的發(fā)生發(fā)展除與基因突變有關(guān)外，表觀遺傳學(xué)異常亦起著重要作用，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最為深入和廣泛的機(jī)制，在此對(duì)DNA甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及甲基化在肝癌臨床診斷與治療中的意義進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是典型的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志［2］。在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA中CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性的添加甲基基團(tuán)，形成5-甲基胞嘧啶。在人類基因組中，DNA甲基化通常發(fā)生在基因的5′端啟動(dòng)子和第1 外顯子“CpG島”區(qū)域，可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用的改變，抑制基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［3-4］。腫瘤的甲基化異常體現(xiàn)在廣泛的低甲基化、個(gè)別基因低甲基化、區(qū)域性高甲基化和印記丟失等。其中，普遍性低甲基化和區(qū)域高甲基化是基因異常表達(dá)的常見機(jī)制。DNA甲基化水平的整體減低影響Cp G雙核苷酸的重復(fù)序列（如長(zhǎng)散步核元件1）以及某些基因特異性啟動(dòng)子Cp G島［5］。DNA低甲基化會(huì)造成基因組的不穩(wěn)定，激活原癌基因（如ras、myc）及其他腫瘤促進(jìn)基因的表達(dá)而誘發(fā)腫瘤。在Cp G島中常見的DNA高甲基化常引起基因轉(zhuǎn)錄沉默，使某些抑癌基因、DNA修復(fù)基因等失活，導(dǎo)致正常細(xì)胞調(diào)控失常及DNA損傷不可逆，從而促進(jìn)腫瘤的形成。

2 DNA甲基化與肝癌的發(fā)生發(fā)展

2.1 DNA甲基化與肝癌的發(fā)生 腫瘤基因D N A甲基化是細(xì)胞癌變過程中一個(gè)早期、頻發(fā)事件，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，肝癌也不例外。盡管肝癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不十分清楚，但越來越多的研究表明啟動(dòng)子Cp G島的異常甲基化導(dǎo)致的抑癌基因失活與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有報(bào)道指出，肝臟線粒體內(nèi)尿素循環(huán)特異性的限速酶氨甲酰磷酸合酶Ⅰ型（carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）在肝癌組織與癌細(xì)胞株中低表達(dá)，用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷處理肝癌細(xì)胞，CPS1表達(dá)恢復(fù)［6］。DNA甲基化是沉默肝癌CPS1 表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制，CPS1 基因的高甲基化與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。Goeppert等［7］采用定量甲基化技術(shù)分別對(duì)肝硬化、癌前病變、肝細(xì)胞癌和正常肝組織中的A型激酶錨定蛋白12（A kinase anchor protein 12，AKAP12）進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)抑癌基因AKAP12 在肝癌發(fā)生過程中分階段下調(diào)。不同的表觀遺傳學(xué)機(jī)制表明，在肝硬化與癌前病變階段miR-183與mi R-186上調(diào)靶標(biāo)AKAP12，使其降低；肝癌時(shí)AKAP12α啟動(dòng)子特異性的高甲基化導(dǎo)致抑癌基因AKAP12 顯著性下調(diào)。肝癌中SOX1 基因及分泌型卷曲相關(guān)蛋白啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化會(huì)導(dǎo)致Wnt／βcatenin 信號(hào)通路的失活。Tsao 等［8］采用甲基化特異性PCR檢測(cè)到SOX1 在Hep3B 肝癌細(xì)胞株與癌組織中因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致下調(diào)，SOX1 過表達(dá)將抑制肝癌細(xì)胞增殖、集落形成與侵襲的能力；另外運(yùn)用熒光素酶報(bào)告分析與蛋白印跡分析證實(shí)SOX1 能夠抑制細(xì)胞外因子Wn t 下游基因的表達(dá)，通過干擾Wnt／β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮抑癌基因作用，影響肝癌的發(fā)生。Nishida 等［9］通過分析179例肝癌組織，178例配對(duì)非癌肝組織以及正常肝臟得出全基因組DNA低甲基化是肝癌形成的重要機(jī)制，在非丙肝性肝癌中較早發(fā)生；同時(shí)是引起肝癌形成早期染色體不穩(wěn)定的重要原因，尤其是非肝硬化演變的肝癌。因此，研究表明多種分子路徑機(jī)制與肝癌的發(fā)生相關(guān)，其中Cp G島甲基化路徑（Cp G island methylator pathyway，CIMP）、泛低甲基化與染色體不穩(wěn)定型路徑都被認(rèn)為普遍存在，采用肝癌甲基化譜的分析是研究的主要技術(shù)手段。

2.2 DNA甲基化與肝癌的分期 肝細(xì)胞癌分期系統(tǒng)地提供了患者評(píng)價(jià)與治療措施的指南，是預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后及臨床研究中根據(jù)預(yù)后變量進(jìn)行疾病分類的主要依據(jù)。DNA甲基化異常在肝癌不同臨床分期有不同的特點(diǎn)及表現(xiàn)。Piao 等［10］采用甲基化特異性PCR及標(biāo)記P704 的雜合性缺失研究等方法，檢測(cè)了39例肝細(xì)胞癌中抑癌基因RIZI 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并對(duì)其甲基化狀態(tài)與臨床病理特征、腫瘤大小分化及片段等位基因缺失（fractional allelic loss，F(xiàn)AL）之間相關(guān)性作了評(píng)估。研究表明，RIZ1 基因啟動(dòng)子在晚期肝癌（＞3 cm）與早期肝癌（＜3 cm）中都出現(xiàn)異常甲基化，分別是58.0%（18／31）與50.0%（4／8）；22例表現(xiàn)出高甲基化，在低分化（低FAL組）與高分化（高FAL 組）腫瘤中甲基化率分別為54.6%和45.5%，其中，4例RIZ1 雙等位基因高甲基化失活。Li 等［11］采用甲基化特異性PCR 研究10 種抑癌基因與CIMP在115例肝癌組織與48例非癌肝組織甲基化狀態(tài)，抑癌基因甲基化率P14為40.0%，P15為60.9%，P16為70.4%，P73為34.8%，GSTP1為70.4%，MGMT為64.3%，hMLH1為13.0%，RARbe t a為59.1%，SOCS-1 為82.6%，OPCML 為80.9%；CIMP 陽性（包含至少6 個(gè)甲基化基因）檢出率為59.1%（68／115）。進(jìn)一步研究證實(shí)，TNM分期Ⅰ期CIMP陽性的肝癌患者總生存期與無瘤生存期相比CIMP 陰性的肝癌患者顯著性降低，并且多變量分析表明CIMP 陽性在TNM分期Ⅰ期的肝癌患者中可作為總生存期（HR＝12.266，P＝0.015）和無瘤生存期（HR＝20275，P＝0.032）的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，CIMP 陽性可以明確解釋在TNM分期Ⅰ期療效不佳的肝癌患者，CIMP的檢測(cè)對(duì)早期肝癌患者預(yù)后分析與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估起著指導(dǎo)研究作用。

2.3 DNA甲基化與肝癌的轉(zhuǎn)移 肝癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多個(gè)基因、多步驟的變化過程，其關(guān)鍵機(jī)制的闡明將為預(yù)測(cè)和防止肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。有研究指出，主要分布于細(xì)胞膜上的CD44v6 基因在轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌樣本中表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移組，且在肝癌細(xì)胞系Hep3B中CD44v6 基因完全甲基化，在具有轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞株MHCC97H與MHCC97L則不完全甲基化［12］；因此DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化影響CD44v6 的表達(dá)，并與肝癌的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體c-Met 調(diào)節(jié)正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，HGF和c-Met 在肝癌中的上調(diào)與其發(fā)展和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。最近Ogunwobi 等［13］分離和建立來自鼠肝癌模型外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞株，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTCs）顯著增高了轉(zhuǎn)移性肝癌致瘤與轉(zhuǎn)移的潛能；其中HGF 和c-Met 在CTCs 中表達(dá)高于原發(fā)性肝癌細(xì)胞，HGF 和c-Met 過表達(dá)與c-Met 啟動(dòng)子區(qū)6 個(gè)特異性CpG位點(diǎn)去甲基化相關(guān)。Lv 等［14］檢 測(cè) 了Hep G2與MHCC 97H肝 癌細(xì)胞株B 細(xì)胞易位基因3（B-cell translocation gene 3，BTG3）啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，BTG3 可抑制肝癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)且誘導(dǎo)體外肝癌細(xì)胞G1／S 周期阻滯。研究表明BTG3 在LO2 肝細(xì)胞株與肝癌組織中低表達(dá)，是由于BTG3基因啟動(dòng)區(qū)高甲基化；BTG3 的表達(dá)水平與肝癌分化及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，低BTG3 表達(dá)的患者總生存期縮短。

3 DNA甲基化與肝癌的診治

3.1 DNA甲基化與肝癌的診斷 相較于基因突變，DNA甲基化改變是細(xì)胞癌變過程中更為早期的事件，腫瘤組織壞死后分解的DNA進(jìn)入外周血（血漿或血清）或其他體液（如唾液或痰等），因此檢測(cè)體液或組織中腫瘤相關(guān)基因甲基化狀態(tài)可應(yīng)用于腫瘤的早期診斷。Tr ?nkenschuh 等［15］采用定量高分辨率焦磷酸測(cè)序，研究了15例纖維板層型肝癌（fibrolame carcinoma of liver，F(xiàn)LC）及配對(duì)正常肝臟組織中APC、CDH1、cyclin D2、GSTπ1、has-mir-9-1、has-mir-9-2 及RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)指出，cyclinD2、RASSF1A、mir-9-1 及mir-9-2 基因在FLC 中甲基化頻率分別為19%、38%、13%和33%；而基因APC 與CDH1 在FLC 中未發(fā)現(xiàn)其甲基化及全基因組低甲基化的依據(jù)，這將為肝癌診斷的進(jìn)一步分型提供分子依據(jù)。Nagashio 等［16］建立了以DNA甲基化譜為基礎(chǔ)的肝癌癌前診斷評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合DNA甲基化譜的診斷標(biāo)準(zhǔn)在受試組中診斷高致瘤風(fēng)險(xiǎn)的敏感性為95.6%，特異性為100%。近來有學(xué)者提出，游離的腫瘤特異性DNA異常甲基化分析為肝癌的早期診斷，開辟了又一無創(chuàng)檢測(cè)的最新技術(shù)手段。Sun 等［17］運(yùn)用甲基化特異性PCR檢測(cè)血清中組織因子途徑抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）在肝癌組、慢性乙型肝炎組與正常對(duì)照組中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示肝癌組血清TFPI2啟動(dòng)子甲基化率為46.5%，明顯高于慢性乙型肝炎組（16.7%）和正常對(duì)照組（19.2%）；血清TFPI2 甲基化的檢測(cè)率為46.5%，非常接近有關(guān)報(bào)道的甲胎蛋白（AFP）的檢測(cè)率54%，聯(lián)合TFPI2啟動(dòng)子甲基化和A FP標(biāo)記物的檢測(cè)率為61.0%。因此，血清TFPI2的甲基化可能成為肝癌診斷的無創(chuàng)性生物分子標(biāo)記物。另外Li 等［18］研究血清胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein-7，IGFBP7）啟動(dòng)子甲基化在乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌中的診斷價(jià)值。研究中檢測(cè)136例肝癌患者、46例乙型肝炎患者及45例健康對(duì)照人群的血清IGFBP7 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，肝癌組甲基化率為65%（89／136）明顯高于乙型肝炎組的17%（8／46）及健康對(duì)照組的14%（5／35），血清IGFBP7 甲基化與AFP的檢測(cè)敏感性分別為65%和57%，聯(lián)合檢測(cè)敏感性達(dá)85%。

3.2 DNA甲基化與肝癌的治療 D N A甲基化由甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，針對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）活性及DNA甲基化模式改變，以此為基礎(chǔ)探討肝癌治療策略，可能成為肝癌治療領(lǐng)域的新思路。DNA甲基化抑制劑都是抗代謝藥物，主要包括：以DNMT作用底物為靶點(diǎn)的藥物，如胞苷類似物5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-Aza-CR）、5-氮 雜-2′-脫 氧 胞 苷（5-Aza-2′deoxycytidine，5-Aza-CdR）等；以DNMT輔助因子SAM為靶點(diǎn)的藥物，如SAM類似物西萘芬凈，抗SAM代謝物Neplanosin等；以及其他如甲氨蝶呤及其類似物、普魯卡因胺等。其中以5-Aza-CdR為代表的抑制劑已廣泛應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的異常甲基化，使失活的基因重新表達(dá)。5-Aza-Cd R被整合到處于分裂期細(xì)胞核內(nèi)的核酸中形成共價(jià)鍵，從而抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶活性，不斷減弱細(xì)胞DNA甲基化的能力，使甲基化的抑癌基因重新活化。近來Tao 等［19］研究5-Aza-Cd R通過抑制肝癌細(xì)胞中端粒酶活性發(fā)揮抗腫瘤的作用。分別采用RT-PCR及Western-blot 檢測(cè)SMMC-7721 和HepG2 肝癌細(xì)胞株相關(guān)基因（如c-myc、p15、p16、p21、E2F1、WT1）的活性，端粒重復(fù)擴(kuò)增酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定端粒酶的活性及DNA甲基化特異性PCR測(cè)定DNA甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)端粒酶活性在用5-Aza-Cd R處理過的兩種肝細(xì)胞癌中明顯降低，隨著端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，h TERT）的下調(diào)，h TERT啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)在作用過5-Aza-CdR的SMMC-7721 肝癌細(xì)胞株中可逆轉(zhuǎn)，Hep G2 肝癌細(xì)胞株卻無此現(xiàn)象。因此5-Aza-Cd R 可增強(qiáng)對(duì)化療藥物的敏感性（如順鉑）誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。此外，Venturelli 等［20］研究指出，5-氮雜胞苷具有雙重抗腫瘤的作用，即既可恢復(fù)惡性腫瘤相關(guān)表型的表觀遺傳狀態(tài)，又可使腫瘤對(duì)凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)［如腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）］進(jìn)行有效的復(fù)敏。另一種非競(jìng)爭(zhēng)性非核苷酸類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如普魯卡因酰胺，作用機(jī)制可能是通過影響酶的活性使胞嘧啶殘基甲基化受阻，而非直接聚合到DNA鏈，臨床試驗(yàn)研究結(jié)果顯示普魯卡因酰胺不良反應(yīng)小，具有臨床靶向生物治療腫瘤的潛力［21］。這些研究說明DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑不失為肝癌化療的一種手段，對(duì)其應(yīng)用價(jià)值的進(jìn)一步探討將會(huì)對(duì)肝細(xì)胞癌的綜合治療起到重要的推動(dòng)作用。

4 展 望

近來肝癌表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展迅速，多種基因的甲基化與肝癌的早期診斷、療效觀察及預(yù)后判斷等臨床關(guān)系已逐漸明確，但肝癌的發(fā)生是多因素參與的復(fù)雜過程，仍有諸多問題尚待研究，如DNA甲基化及組蛋白乙?；?、甲基化和磷酸化與肝癌的關(guān)系、甲基化與染色體重構(gòu)的關(guān)系等。此外，雖然DNA甲基化抑制劑在臨床試驗(yàn)中顯示出良好的前景，但藥物使用的種類、途徑及時(shí)間等還不夠成熟，在療效和不良反應(yīng)方面還不令人滿意。因此，在臨床上需要選擇特異性更強(qiáng)，敏感性更高的甲基化基因應(yīng)用于肝癌患者，實(shí)現(xiàn)肝癌的分子靶向治療。

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