蔣 婷，楊澤龍，白 倩，張?zhí)m芳，雷 英，周廣東，劉 偉

（1.川北醫(yī)學院第二臨床學院／南充市中心醫(yī)院燒傷整形美容外科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學院第二臨床學院／南充市中心醫(yī)院骨科，四川南充637000；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整形外科／上海市組織工程重點實驗室 200011）

成體干細胞因其分布廣、增殖力強且具有多分化潛能而成為當前組織工程種子細胞研究的重點。成體干細胞可來源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉、角膜等各類組織。其中以骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）研究最多，應用最廣。隨著研究的不斷深入，脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ASCs）逐漸被人 們發(fā) 現(xiàn)并廣泛研 究。1994年，Kaplan 等［1］報道了患者皮下脂肪組織存在異位成骨的現(xiàn)象，提出脂肪前體細胞具有成骨細胞分化的潛能。Zuk 等［2］于2001年從脂肪抽吸物的上層脂肪組織中成功分離培養(yǎng)出具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細胞。同年，Gronthos 等［3］對脂肪抽吸物培養(yǎng)細胞的表面標記進行了系統(tǒng)的研究，結果表明這些脂肪細胞具有與骨髓間充質干細胞相似的表面抗原表達，CD29、CD105、CD106、CD166 等干細胞相關表面抗原均有一定的陽性率，并明確指出脂肪干細胞的確存在，脂肪干細胞的概念由此正式提出。此后人們對脂肪干細胞作了大量的研究［4-6］，但主要集中于人來源的ASCs，對小鼠脂肪組織來源的ASCs 研究相對較少。小鼠是醫(yī)學研究領域中常用的實驗動物之一，本實驗室以小鼠為動物模型進行了大量的研究，應用脂肪干細胞進行多種組織工程化組織構建，需要大量優(yōu)質的種子細胞。本研究以小鼠作為試驗動物模型，擬建立一種簡單高效的體外分離培養(yǎng)小鼠脂肪干細胞（mouse adipose-derived stem cells，m ASCs）的方法，對其表面標志和多向分化潛能進行鑒定，為進一步分析小鼠脂肪干細胞的生物學特性提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 6～8周齡C57BL／6雌雄小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。膠原酶NB4（Serva公司），DMEM（HyClone 公司），胎牛血清（SAFC Bioscience 公司），TGF-β3、BMP6 及IGF1（R＆D公司），Ⅱ型膠原抗體（Neo Markers 公司），流式抗體（eBioscience 公司）。

1.2 m ASCs 體外分離與培養(yǎng) 實驗小鼠斷頸處死后浸泡于75%乙醇中15 min，無菌條件下切取收集雙側腹股溝脂肪組織。將收集的脂肪組織剪碎后置于50 m L的離心管內，加入適量的氯霉素浸泡15 min（以沒過脂肪組織為宜）后2～3 倍體積的PBS 沖洗3次。選擇離心半徑11.5 cm，速度為1500 r／min 離心5min 后棄上清液，再加入5 倍體積的0.1%膠原酶NB4，將離心管置于37 ℃恒溫汽浴搖床內消化1.5～2.0 h，150 目無菌網(wǎng)篩濾去未被消化的殘余組織。選擇離心半徑11.5 cm、速度為1500 r／min 離心5 min，棄上清液，細胞沉淀用PBS 洗滌2 次，以同前參數(shù)再次離心棄上清液，收集所獲得的細胞計數(shù)并按1 ×105個／cm2的密度，將其種植于培養(yǎng)皿內，加入低糖DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、100U／mL青霉素和100 mg／m L 鏈霉素）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 天換液，待細胞生長達到90%融合時消化傳代。用0.25%胰蛋白酶消化后接種于新的培養(yǎng)皿，傳代接種的細胞密度為（0.5～1.0）×104個／cm2。當再次達到90%融合時，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.3 生長曲線 分別取第2、8 代m ASCs，消化，制備成濃度為1 ×104個／mL單細胞懸液。將細胞懸液按每孔1mL的量接種于24 孔培養(yǎng)板內，并將其分為8 組，每組3 孔。接種培養(yǎng)后第1 天用0.25%胰蛋白酶消化第1 組，制成細胞懸液1 mL，加入PBS 液19mL 稀釋成20mL 的細胞懸液，對其進行計數(shù)并取平均值。此后每天消化一組并按同樣的方法計數(shù)取平均值，至第8 天結束。將所獲得的數(shù)據(jù)繪制生長曲線，并計算群體倍增時間。

1.4 表面標記流式分析 用流式細胞儀對第二代細胞的表面特異性抗原進行檢查。0.1%胰蛋白酶消化待檢細胞，收集細胞，離心5 min（1500 r／min），棄培養(yǎng)液，PBS 重懸，過單細胞濾網(wǎng)，將其制成單細胞懸液，血細胞計數(shù)儀計數(shù)，調整細胞濃度為（0.5～1.0）×106個／mL，吸取1 mL細胞懸液加入1.5 m L eppendorf 管中，離心，將沉淀細胞用100μL 1%BSA重懸，加入0.5μL待檢抗體，4 ℃孵育30 min，離心，PBS 沖洗。最后細胞用4%多聚甲醛固定，樣品用流式細胞儀分析鑒定。分別設實驗組、同型對照組、空白對照組。每組標本3例，取平均值。

1.5 體外分化潛能檢測 第2 代mASCs，按1 ×104個／孔的密度接種于24 孔板，進行成脂、成骨及成軟骨誘導。成脂誘導液配制參考文獻［7］，m ASCs 經(jīng)誘導2 周后進行油紅染色；成骨誘導液及成軟骨誘導液配制參考文獻［7］，m ASCs 分別誘導4 周后進行茜素紅染色以觀察鈣鹽沉積情況；行Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原的分泌情況。

1.6 特殊染色及免疫組化染色 油紅染色：細胞經(jīng)4%甲醛4 ℃固定1 h，蒸餾水沖洗，加入60%異丙醇，室溫放置1 min，吸盡后加入2%油紅試劑（wt／vol），室溫放置5～10 min，60%異丙醇洗去多于染液，蒸餾水沖洗后觀察。

Alizarn Red染色：細胞經(jīng)70%冷乙醇4℃固定1 h，蒸餾水沖洗3 遍，茜素紅染液室溫作用10 min，蒸餾水沖洗多余染液，倒置相差顯微鏡觀察拍照。

Ⅱ型膠原免疫組化染色：細胞經(jīng)4%多聚甲醛4 ℃固定10～15 min，PBS 沖洗3 min，（0.25% Triton-100，5%DMSOPBS）穿膜處理10 min，PBS 洗3 次，每次5 min，非特異性抗原封閉，加入Ⅱ型膠原抗體4 ℃過夜，抗小鼠二抗37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3min，DAB 顯色，封片，鏡檢拍照。

2 結 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長及形態(tài)學特點 原代分離的小鼠脂肪干細胞呈體積較小的圓球形，1～2 h 開始貼壁生長，6 h 左右細胞伸展開來，呈短梭形，胞體可形成具有較強折光性的細胞外基質，高倍鏡下細胞輪廓清晰（圖1）。5 d左右達到90%以上匯合狀態(tài)時傳代，傳代接種的細胞密度為（0.5～1.0）×104個／cm2，傳代后細胞增殖迅速，常于傳代后3 d 再次接近匯合狀態(tài)。傳代到第10 代仍有很強的增殖能力。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察m ASCs 的原代細胞形態(tài)

2.2 生長曲線 生長曲線顯示培養(yǎng)的第2、8 代細胞均具有很強的分裂增殖能力，均存在24 h 停滯生長期，第3～4 天體外擴增速度相似，為對數(shù)增殖期。而在第6 天時第2、8 代細胞生長均處于停止狀態(tài)。該研究結果表明，m ASCs 第2、8 代細胞傳代接種后的潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期無顯著差異（圖2），群體倍增時間大約為48 h，傳10 代后細胞無明顯的衰老征象。

圖2 生長曲線

2.3 流式細胞儀檢測結果 第2代小鼠脂肪干細胞表達CD34（10.97±2.03）%、CD105（11.78±1.56）%、CD133（1.63±0.38）%，高表達Sca-1（80.57±5.71）%，幾乎不表達CD45（0.07±0.03）%、SSEA-1（0.02±0.01）%。

2.4 體外分化潛能檢測 成脂誘導7 d 左右，鏡下觀察有脂滴出現(xiàn)，隨著誘導時間的延長，脂滴逐漸增多，變大，2 周時停止誘導，油紅染色顯示脂滴呈桔紅色（圖3A）；對照組無脂滴出現(xiàn)，油紅染色呈陰性（圖3B）。成骨誘導4 周行茜素紅染色，誘導組有鈣結節(jié)形成，染色呈紅色（圖3C）；對照組染色呈陰性（圖3D）。成軟骨誘導6 d 左右，誘導組有部分細胞聚集成小球狀，非誘導組則無，誘導4 周時Ⅱ型膠原免疫組化染色誘導組表達軟骨特異基質Ⅱ型膠原，染色呈棕色（圖3E），對照組無陽性染色出現(xiàn)（圖3F）。

圖3 m ASCs 體外分化潛能檢測（×100）

3 討 論

組織工程技術是目前最有前景的生理性修復技術。然而，種子細胞來源不足、功能老化等問題嚴重限制了其發(fā)展與應用。脂肪干細胞因其體內分布廣，取材創(chuàng)傷小，細胞獲得量大且擴增能力強等優(yōu)點，已成為一種有希望的種子細胞。研究表明，脂肪間充質干細胞在體外特定條件下可分化為多種細胞類型及表達間充質干細胞相關抗原［8-11］。小鼠動物模型取材方便，可重復性強，便于有關基礎研究的實施等優(yōu)點目前應用廣泛。小鼠脂肪干細胞分離培養(yǎng)方法主要參照人脂肪干細胞，目前通常采用Ⅰ型膠原酶進行消化［12-14］。脂肪組織主要是由大量脂肪細胞集聚而成，疏松結締組織將成群的脂肪細胞分隔成許多脂肪小葉。疏松結締組織中含有除Ⅰ型膠原外的多種膠原纖維及蛋白多糖和糖蛋白等，本研究應用膠原酶NB4（包含Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶）消化小鼠腹股溝皮下脂肪組織，組織消化更完全，細胞獲得量更大。小鼠脂肪干細胞培養(yǎng)基通常為DMEM／F12 加胎牛血清（5%或10%）［15-16］，本法采用低糖DMEM加10%胎牛血清，貼壁培養(yǎng)，細胞增殖迅速，體外多次傳代仍保持較強的增殖能力。原代分離的小鼠脂肪干細胞呈集落狀生長，傳代后的細胞生長速度較原代細胞明顯增快，體外多次傳代后仍保持較強的增殖能力。通過測定小鼠脂肪干細胞的生長曲線，證實其體外培養(yǎng)時分裂增殖能力強，潛伏期較短。本研究進一步鑒定該分離培養(yǎng)方法所獲得的細胞表面標記及多向分化潛能，以證實其干細胞特性。對小鼠脂肪干細胞進行成脂誘導后，油紅染色胞質中脂滴呈桔紅色，成骨誘導后有鈣結節(jié)形成，成軟骨誘導后表達軟骨特異基質Ⅱ型膠原，表明其具有向脂肪、骨及軟骨分化潛能。經(jīng)流式細胞儀鑒 定，CD34、CD105陽 性，Sca-1高 表 達，不 表 達CD45及SSEA-1，其具有與文獻報道相似的表面標記［15］。在人脂肪干細胞中，CD105 與軟骨分化潛能具有高度相關性［17］，本法獲得的小鼠脂肪干細胞第2 代CD105 表達量為（11.78±1.56）%，其與軟骨潛能相關性有待進一步證實。結果表明，本研究從小鼠脂肪組織中分離到的間充質干細胞具有多向分化潛能，及與文獻報道相一致的表面標記。本分離培養(yǎng)方法操作簡單、易于推廣、細胞獲得量大、質量優(yōu)良，能很好地滿足組織構建對種子細胞量大質優(yōu)的需求。

［1］ Kaplan FS，Hahn GV，Zasloff MA.Heterotopic ossification：two rare forms and what they can teach us［J］.J Am Acad Orthop Surg，1994，2（5）：288-296.

［2］ Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies［J］.Tissue Eng，2001，7（2）：211-228.

［3］ Gronthos S，F(xiàn)ranklin DM，Leddy HA，et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells［J］.J Cell Physiol，2001，189（1）：54-63.

［4］ Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates［J］.J Cell Physiol，2006，208（1）：64-76.

［5］ Mcintosh K，Zvonic S，Garrett S，et al.The immunogenicity of human adipose-derived cells：temporal changes in vitro［J］.Stem Cells，2006，24（5）：1246-1253.

［6］ Halvorsen YD，F(xiàn)ranklin D，Bond AL，et al.Extracellular matrix mineralization and osteoblast gene expression by human adipose tissue-derived stromal cells［J］.Tissue Eng，2001，7（6）：729-741.

［7］ 蔣婷，張瑩瑩，劉偉，等.MesenPRO RS Medium對人脂肪干細胞增殖與分化的影響［J］.組織工程與重建外科雜志，2009，5（5）：241-244.

［8］ Erickson GR，Gimble JM，F(xiàn)ranklin DM，et al.Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，290（2）：763-769.

［9］ Bacou F，el Andalousi RB，Daussin PA，et al.Transplantation of adipose tissue-derived stromal cells increases mass and functional capacity of damaged skeletal muscle［J］.Cell Transplant，2004，13（2）：103-111.

［10］ 李戰(zhàn)梅，劉康，馮剛，等.生長分化因子5 促進脂肪干細胞成軟骨分化的實驗研究［J］.西部醫(yī)學，2010，22（8）：1380-1384.

［11］ Mitchell JB，Mcintosh K，Zvonic S，et al.Immunophenotype of human adipose-derived cells：temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers［J］.Stem Cells，2006，24（2）：376-385.

［12］ 張自強，金巖，李裕強，等.犬脂肪間充質干細胞體外分離培養(yǎng)及其多向分化潛能［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（42）：8524-8527.

［13］ 郝丹，段顯琳，畢曉娟，等.小鼠脂肪源干細胞分離培養(yǎng)和成骨誘導前后造血調控因子的表達［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2012，16（1）：51-55.

［14］ Yu G，Wu X，Kilroy G，et al.Isolation of murine adiposederived stem cells［J］.Methods Mol Biol，2011（702）：29-36.

［15］ Yamamoto N，Akamatsu H，Hasegawa S，et al.Isolation of multipotent stem cells from mouse adipose tissue［J］.J Dermatol Sci，2007，48（1）：43-52.

［16］ 劉壽生，雷俊霞，黎陽，等.小鼠脂肪間充質干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性分析［J］.中山大學學報：醫(yī)學科學版，2012，33（3）：299-304.

［17］ Jiang T，Liu W，Lv X，et al.Potent in vitro chondrogenesis of CD105 enriched human adipose-derived stem cells［J］.Biomaterials，2010，31（13）：3564-3571.