曹恬雪，蔣文燦,2*，何文成，紀鳳仙，魏志剛

(1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

沙門氏菌(Salmonella)感染可以引起人和動物的傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病，還可以造成懷孕母畜發(fā)生流產。不但導致畜禽死亡，還會因生長遲緩、產量下降等造成重大的經濟損失。沙門氏菌也是人類食物中毒的主要病原之一，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。

研究表明沙門氏菌的致病性是由大量的毒力因子相互作用所致。本文對國內外在沙門氏菌的結構性毒力因子、腸毒素、毒力質粒、毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等方面的研究進展進行綜述，以期為開展相關研究提供參考。

1 結構性毒力因子

1.1 菌毛菌毛是細菌表面的纖細結構，與細菌黏附上皮細胞及在小腸粘膜的定植有關。根據(jù)菌毛形態(tài)和凝集紅細胞的能力，沙門氏菌菌毛主要分為4類。Ⅰ型和Ⅱ型菌毛形態(tài)相似，Ⅰ型菌毛廣泛分布于沙門氏菌屬內，Ⅱ型菌毛僅在雞白痢、都柏林、乙型副傷寒等沙門氏菌中被發(fā)現(xiàn)。Ⅰ型菌毛可以介導甘露糖敏感血凝反應，而Ⅱ型菌毛缺乏凝集紅細胞的能力。Ⅲ型和Ⅳ型菌毛形態(tài)相似，較細而且容易彎曲，在甘露糖存在時仍可凝集鞣酸處理的紅細胞。Ⅲ型菌毛只在腸炎、鼠傷寒等沙門氏菌中表達，Ⅳ型菌毛的報道較少。沙門氏菌還有兩種體積差異較大而且缺乏凝集紅細胞能力的菌毛，按其主要亞單位蛋白大小命名為 SEF14 和 SEF17[1]。

菌毛有助于菌體黏附到動物細胞并促進其定植，同時帶菌毛菌株的致病力和活力均強于先天無菌毛菌株或菌毛缺失的菌株。沙門氏菌菌毛作為抗原被廣泛應用于免疫和病原的檢測方面。研究表明腸炎沙門氏菌Ⅰ型和Ⅲ型菌毛抗原免疫小鼠存活率提高60%，從而預測腸炎沙門氏菌SEF14、SEF17和SEF21等多種菌毛的聯(lián)合免疫可以產生更好的保護效果[2]。根據(jù)SEF14柔毛抗原的特性，Rajashekara等建立了一種簡便的乳膠凝集試驗成功區(qū)別檢測腸炎沙門氏菌的感染[3]。近年，國內研究者利用鼠傷寒沙門氏菌SEF14菌毛基因agfA作為禽流感疫苗載體，構建能夠引起機體細胞免疫的活體重組疫苗，對禽流感的預防具有重要意義[4]。

1.2 外膜蛋白外膜蛋白(Outer membrane protein)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構成分。按其在細胞中的拷貝數(shù)高低，沙門氏菌的外膜蛋白可分為外膜A蛋白(OmpA)、微孔蛋白、脂蛋白和微量蛋白。OmpA屬于跨膜蛋白，對外膜結構的維持起著重要作用。缺乏OmpA的突變株細菌的外膜蛋白不穩(wěn)定，不能轉運肽類，氨基酸總轉運率下降，并且失去F因子介導的細胞接合功能。當OmpA溶于高于50℃的SDS溶液中，其分子量增加，因此OmpA又稱熱修飾蛋白。微孔蛋白也稱為基質蛋白，是一類具有滲透特性的主要外膜蛋白。它以非共價鍵與肽聚糖緊密結合而形成相對非特異性的通道，因此具有通透特性。脂蛋白則為細胞外膜中含量最豐富的結構蛋白，但并不是細菌生長所必需的，有利于維持外膜結構的穩(wěn)定性。微量蛋白在細胞內含量低，卻具有相當重要的功能；許多微量蛋白(如TonA、FepA等)與細胞生長密不可分。

傷寒沙門菌的OmpD參與巨噬細胞和腸上皮細胞對細菌的識別；微孔蛋白能觸發(fā)多重協(xié)同信號轉導途徑，誘發(fā)細胞激活及細胞因子釋放，增強蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶A及蛋白激酶C等[5-6]。傷寒菌的ompS1、ompS2基因編碼與OmpC、OmpF蛋白相關的兩個低水平表達的外膜蛋白，利用該基因的突變菌株感染小鼠，其毒力比野生株明顯降低[7]。傷寒菌外膜蛋白及鐵調節(jié)外膜蛋白能刺激宿主產生細胞和體液免疫反應[8]，具有良好的免疫保護性，因而可用于高效價抗體和疫苗的研制。利用反應性關節(jié)炎患者的血清及關節(jié)液進行ELISA檢測，表明傷寒菌的外膜蛋白是觸發(fā)反應性關節(jié)炎的細菌組分[9]。研究表明鼠傷寒沙門氏菌的OmpA能夠刺激樹突細胞產生抗腫瘤免疫，為抗腫瘤的免疫治療提供了新途徑[10]。

1.3 脂多糖脂多糖(Lipopolysaccharides)位于革蘭氏陰性菌外膜的最表面，在細菌崩裂時釋出，是很強的發(fā)熱原。沙門氏菌的脂多糖主要由類脂A、核心多糖和側鏈多糖組成，在防止宿主吞噬細胞的吞噬和殺傷作用中起重要作用。類脂A是構成內毒素的主要部分，吞噬細胞相應受體識別類脂A的特定結構而引起相應的炎癥反應。在對鼠傷寒沙門氏菌脂多糖的研究中顯示，脫酰酶LpxR過量表達時引起類脂A的3'-O-脫酰作用脫掉兩條?；?，類脂A的結構發(fā)生改變，而不能被吞噬細胞相應受體識別，從而有利于細菌在吞噬細胞中增殖；另一種脫酰酶PagL隱藏于細菌外膜上，某些點突變可使PagL從隱藏區(qū)域釋放出來，沉淀分析顯示隱藏的PagL與脂多糖相關，而釋放出的PagL突變體卻與膜蛋白相關，這種突變會影響PagL與脂多糖之間的相互作用[11]。

側鏈多糖在LPS的最外側，即O抗原。Kumirska等利用核磁共振波譜法及質譜分析法，首次從沙門氏菌血清群O∶28的101種血清型中確定一種特殊的O抗原單位結構，這在沙門氏菌血清分型中具有重大意義[12]?？怪嗵菃慰寺】贵w對雞白痢沙門氏菌和其他血清群沙門氏菌都具有特異性，可以用于沙門氏菌檢測方法研究[13]。用缺失LPS和恢復LPS的沙門氏菌SstpNPG分別感染小牛，在所有小牛的血液及腦組織中都能檢測到SstpNPG，但只有LPS恢復株引起實驗小牛的神經癥狀。該研究首次證明牛的非傷寒沙門氏菌腦病的臨床癥狀與脂多糖有關[14]。

1.4 莢膜早期對傷寒沙門菌的研究表明有莢膜菌株比莢膜缺失菌株引起發(fā)病率高，莢膜是沙門氏菌重要的毒力因子。莢膜也具有一定的抗原性又稱為Vi抗原。莢膜能夠阻斷O抗原與其相應抗體的反應，對細菌本身具有保護作用。傷寒沙門菌的莢膜對其存活于宿主體內及逃避機體的防御機理具有重要作用。近年，莢膜多糖免疫法開始用于預防傷寒沙門氏菌病。莢膜多糖的產生依賴于細菌的生長，通過補料分批培養(yǎng)優(yōu)化傷寒沙門氏菌生長過程中產生的莢膜多糖，結果表明莢膜多糖的合成與營養(yǎng)成分及發(fā)酵條件密切相關，在細菌生長初期和穩(wěn)定期，高濃度的葡萄糖會抑制莢膜多糖的合成[15]。根據(jù)Vi分子帶負電荷、Vi在不同溶劑中的選擇性溶解度以及橫向氣流微濾等條件最大化地除去雜質，使得最終獲得高純度的莢膜多糖，該方法可用于規(guī)模化生產，其產量高且成本低，為制備莢膜多糖疫苗提供了有效途徑[16]。

莢膜多糖的保護性取決于O-乙?；鶊F的存在，利用Vi抗血清作為酶免疫分析法(EIA)的陽性抗體，進行傷寒沙門菌莢膜多糖的O-乙酰基團的檢測，并用核磁共振法對比其靈敏度，表明EIA能夠鑒別O-乙酰化與非O-乙?；那v膜多糖樣品，但對于O-乙?；降陀?5%的樣品，該方法靈敏度低；Vi抗血清可用來檢測莢膜多糖亞單位疫苗中菌莢膜多糖的O-乙?；?，以評價其免疫原性，有利于對莢膜多糖疫苗的質量控制[17]。將傷寒沙門氏菌莢膜多糖與白喉類毒素結合后接種小鼠并檢測其抗體水平，結果表明莢膜多糖結合白喉類毒素的量越多其免疫保護性就越強，利用該結合物(Vi-DT)免疫接種能夠克服單獨使用莢膜多糖引發(fā)的免疫抑制，從而建立了Vi-DT的理化特性與免疫應答反應之間的相關性[18]。

2 腸毒素

外毒素是病原菌在生長繁殖過程中產生的對宿主細胞有毒性的可溶性蛋白質。外毒素有極強的毒性作用，也具有良好的免疫原性。在0.4%甲醛溶液作用下外毒素可脫毒為類毒素，但仍保留其原有的抗原性，可作為疫苗進行免疫接種。沙門氏菌腸毒素與宿主腹瀉等癥狀有關，有研究顯示其作用機制與霍亂毒素、大腸桿菌腸毒素相似。早期研究中在鼠傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)一種熱敏的、細胞結合型的霍亂毒素(CT)樣腸毒素，可引起CHO細胞伸長；在兔結扎腸中誘導液體分泌，與GM1神經節(jié)苷脂結合，可提高兔腸細胞內cAMP和前列腺素E2水平；其生物學活性可被抗CT抗體所中和。利用γ射線處理沙門氏菌腸毒素，獲得的類毒素沒有毒性但保持原有的免疫原性，從而制備類毒素疫苗，口服和腹腔注射實驗小鳥保護率平均達到95%以上。表明γ射線脫毒方法具有安全便捷的特點，同時可避免動物機體對傳統(tǒng)甲醛疫苗產生的應激反應[19]。

研究表明腸毒素(stn)基因是鼠傷寒沙門菌感染機制中重要的毒力因子之一，其編碼產物能誘發(fā)小鼠腸腔液體分泌反應[20]。此外，Akinyemi等為檢測水源中沙門氏菌的多重耐藥性和腸毒素基因的情況，從當?shù)仉S機采集200個樣品分離沙門氏菌并進行藥敏試驗和stn基因檢測，結果37個樣含有沙門氏菌，這些菌分屬于7個血清型；其中60%含有stn基因，而且攜帶有stn基因的菌群表現(xiàn)出對多種抗生素的抵抗力。因此，腸毒素基因對細菌的耐藥性有一定水平的提高[21]。

3 毒力相關基因

沙門氏菌毒力基因存在其染色體和質粒中。在沙門菌染色體中編碼毒力相關基因的特定區(qū)域被稱為毒力島(SPI)，含有許多與毒力有關的基因，還編碼與細菌侵襲力直接相關的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。除染色體中毒力島編碼的毒力基因外，還有小部分毒力基因位于質粒中。

3.1 毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)

3.1.1 毒力島 沙門氏菌的SPI1、SPI2、SPI3、SPI4和SPI5已研究比較清楚。SPI1位于沙門菌染色體上、下游分別為fhlA和mutS的63'位點處，至少含29個基因與Ⅲ型分泌系統(tǒng)各組分的編碼相關；SPI1編碼的蛋白可以侵入宿主細胞并誘導巨噬細胞凋亡，在沙門氏菌侵襲巨噬細胞和腸上皮細胞過程中發(fā)揮重要作用。SPI2含40個基因，組成4個操縱子，ssa編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)成分，ssr編碼分泌系統(tǒng)調節(jié)子，ssc編碼分子伴侶，sse編碼分泌系統(tǒng)效應蛋白；SPI2控制沙門氏菌在吞噬細胞和上皮細胞內的復制，并使沙門氏菌逃避巨噬細胞輔酶依賴的殺傷作用。SPI3含 10個 ORFs，組成 6個轉錄單位，其中mgtCB的產物可介導細菌在巨噬細胞和低Mg2+環(huán)境中存活。研究表明攜帶SPI1+SPI2與沙門氏菌的致病性呈正相關，而且SPI3可作為檢測沙門氏菌的毒力標志[22]。SPI4含18個ORFs，編碼介導毒素分泌的Ⅰ型分泌系統(tǒng)，并參與調節(jié)細菌對巨噬細胞內環(huán)境的適應[23]。SPI5位于都柏林沙門氏菌染色體25'處，上、下游分別為serT和copS/copR，含sop、sip、pip等基因，編碼產物與腸黏膜液體分泌和炎癥反應相關，并且由SPI1和SPI2編碼的蛋白所調控[24]。

近期陸續(xù)報道了在傷寒、鼠傷寒、丙型副傷寒等沙門氏菌中新鑒定出SPI6、SPI7、SPI8、SPI9、SPI10、SPI11、SPI12等。SPI6通過引導伴侶蛋白調節(jié)菌毛操縱子；SPI7在丙型副傷寒沙門氏菌中被鑒定出，具有血清特異性，編碼sopE噬菌體、Vi抗原基因和ⅣB操縱子[25]；SPI8與pheVtRNA基因相連，編碼2種細菌素的偽基因及整合酶基因；SPI9編碼Ⅰ型分泌系統(tǒng)和獨立的Rtx2樣蛋白，與SPI4相似；SPI10包含sefB、sefC和sefR基因，編碼sefA-R和噬菌體以及引導伴侶蛋白調控菌毛操縱子[26]。

3.1.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng) 沙門氏菌的T3SS分別由SPI1和SPI2的基因編碼產物組成，包括外膜蛋白、內膜蛋白、附屬蛋白及一些特異性靶蛋白。T3SS有兩大功能：一是指導細菌蛋白轉運至宿主細胞，并激活相關的信號通道，使宿主細胞產生細胞因子，以誘導巨噬細胞凋亡；二是促使與宿主細胞接觸的侵襲小體在細菌表面的裝配。T3SS可分泌幾種效應蛋白刺激宿主細胞的信號轉導途徑，引起一系列細胞反應[27]。該分泌和轉移過程是由非常復雜的轉錄機制和轉錄后機制調控的。轉錄機制的調控主要受時間和空間的限制，轉錄后調控機制在與宿主細胞相互接觸后發(fā)揮其功能，侵入基因表達的調控由轉錄水平的環(huán)境因素決定。目前，在分子水平僅發(fā)現(xiàn)DNA的超螺旋結構會影響蛋白的分泌；在蛋白水平，AraC家族的InvF和OmpR/ToxR家族的HilA參與沙門氏菌的侵入，HilA又調節(jié)OrgA、SipC和InvF，它們形成一個調控莖環(huán)結構[28]。此外，T3SS還受到調控網的影響，如菌毛調控系統(tǒng)、PhoP/PhoQ調控系統(tǒng)[29]和反應調節(jié)蛋白等。

3.2 毒力質粒 早期研究表明，在能引起嚴重全身性感染的沙門菌中普遍存在一大小約50 kb～90 kb的質粒，與沙門菌的毒力密不可分，將其稱為沙門氏菌毒力質粒(Salmonellaplasmid virulence，spv)。毒力質粒含有一段高度保守的約8 kb的核酸片段，即spv基因。該基因由6個ORFs構成：正性調控基因spvR、4個效應基因spvA、spvB、spvC、spvD以及位于這5個基因之后的orfE。目前已知spvR編碼LysR/MetR家族轉錄活化因子的細菌調節(jié)性蛋白，并且使基因按照合成SpvABCD的方向進行轉錄[25]。劉華偉等針對spvR基因設計PCR引物，用于檢測細菌樣品，可快速特異性檢測出具毒力質粒的沙門氏菌[30]。spvB編碼一個65 ku的單鏈多肽，spvA、spvC、spvD分別編碼大小為28.2 ku、28 ku及24.8 ku的蛋白。研究表明，spv基因有利于沙門氏菌在腸外組織細胞內的生長，其產物與細菌的粘附、定植及血清抗性等毒力表型密切相關。研究還表明，spv基因是細菌在巨噬細胞內存活和生長繁殖所必需的，毒力表現(xiàn)為細胞毒性，細菌增殖可致巨噬細胞凋亡[31]。

4 小 結

沙門氏菌的菌毛、外膜蛋白、脂多糖、莢膜等均屬于重要的菌體結構成分，目前，沙門氏菌結構性毒力因子的生物學特性及致病機制方面已研究的比較透徹，并且在臨床應用方面不斷獲得新的研究成果。多數(shù)毒力因子都具有良好的免疫原性，比如將白喉類毒素結合到莢膜多糖上增強其抗原性，為疫苗的研制打開了新思路。近年來，毒力相關的基因逐步成為研究重點，包括編碼結構性毒力因子的基因、腸毒素基因和某些調節(jié)基因。這些基因主要存在于沙門氏菌的染色體和質粒中，因此毒力質粒和毒力島等方面的研究不斷深入，成為沙門氏菌研究的熱點之一。目前，關于沙門氏菌已知的5個毒力島研究較為清楚，近期也有新的毒力島被鑒定出來，是否還有其他潛在的毒力島還有待進一步研究。利用基因敲除等方法除去沙門氏菌的毒力部分，獲得的減毒沙門氏菌可作為載體或佐劑，其應用也十分廣泛，不斷開發(fā)出新的生物制品，對預防沙門氏菌病及其他傳染病具有重要意義。減毒沙門氏菌將是現(xiàn)在到將來很長一段時間內的重點研究對象之一。

[1]朱春紅.腸炎沙門氏菌sefA基因表達和間接ELISA檢測方法的初步建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(1)：44-48.

[2]Aslanzadeh J.Adherence and pathogenesis of Salmonellaenteritidis in mice[J].Microbiol Immunol,1990,34(11):85-93.

[3]Rajashekara G,Munir S,Lamichhane C M,et al.Application of recombinantfimbrialprotein for the specific detection of Salmonellaenteritidis infection in poultry[J].Diagn Microbiol Infect Dis,1998,32(3):147-157.

[4]鄧路瑤，趙梓名.禽流感抗原表位在沙門氏菌菌毛的表達[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2007，7(9)：1290-1293.

[5]Hara-Kaonga B,Pistole T G.OmpD but not ompC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimuriumto human cells[J].Can J Microbiol,2004,50(9):719-727.

[6]Galdiero M,D'Isanto M,Vitiello M,et al.Monocytic activation of protein tyrosine kinase,protein kinase A and protein kinase C induced by porins isolated from Salmonellaentericserovar Typhimurium[J].Infect,2003,46(2):111-119.

[7]Rodriguez M O,Fernandez M M.Salmonella enterica serovar TyphimuriumompS1 and ompS2 mutants are attenuated for virulence in mice[J].Infect Immune,2006,74(2):1398-1402.

[8]Sood S,Rishi P,Vohra H,et al.Cellular immune response induced bySalmonellaenterica serotype typhi iron-regulated outer membrane proteins at peripheral and mucosal levels[J].Med Microbiol,2005,54(9):815-821.

[9]Singh R,Shasany A K.Low molecular weight proteins of outer membraneofsalmonellatyphimurium areimmunogenicin Salmonellainduced reactive arthritis revealed by proteomics[J].Clin EXP Immunol,2007,148(3):486-493.

[10]Min J J.Dendritic cells stimulated with outer membrane protein A(OmpA)ofSalmonella typhimuriumgenerate effective antitumor immunity[J].Vaccine,2011,(29):2400-2410.

[11]Takayuki M,Miyuki K,Kiyoshi K.Mutations in the lipid A deacylase PagL which release the enzyme from its latency affect the ability of PagL to interactwith lipopolysaccharide in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Biochem Biophys Res Comm,2010,396:812-816.

[12]Jolanta K,Janusz S.The structure of the O-polysaccharide isolated from the lipopolysaccharide of SalmonellaDakar(serogroup O:28)[J].Carbohyd Res,2007,342:2138-2143.

[13]Brook B W.Structural characterization and serological specificities of lipopolysaccharides fromSalmonella enterica serovar Gallinarumbiovar Pullorumstandard,intermediate and variant antigenic type strains[J].Vet Microbiol,2008,126:334-344.

[14]Xiong N,Brewer M T,Anderson K L,et al.Non-typhoidal Salmonellaencephalopathy involving lipopolysaccharide in cattle[J].Vet Microbiol,2012,5883:1-3.

[15]Hyun J,Yeon K Y.Optimization of Vi capsular polysaccharide production during growth of Salmonellaenterica serotype Typhi Ty2 in a bioreactor[J].J Biotechnol,2008,135:71-77.

[16]Kothari S,Kothari N,Lee E,et al.Development of an efficient and scalable method for processing and purification of Vi capsular polysaccharide[J].Proce Vaccinol,2010,2:78-81.

[17]Rijpkema S,Durrani Z.Detection of O-acetylated Vi polysaccharide of Salmonellaenterica subspecies typhi by enzyme immunoassay[J].Biologicals,2004,32:11-16.

[18]An S J,Yoon Y K,Kotharia S,et al.Immune suppression induced by Vi capsular polysaccharide is overcome by Vi-DT conjugate vaccine[J].Vaccine,2012,30:1023-1028.

[19]Begum R H,Rahman H,Ahmed G.Development and evaluation of gamma irradiated toxoid vaccine of Salmonella enterica var Typhimurium[J].Vet Microbiol,2011,153:191-197.

[20]黃建華.鼠傷寒沙門菌腸毒素基因功能與毒力作用的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2001，21(1)：10-13.

[21]Akinyem K O,Iwalokun B A,Foli F,et al.Prevalence of multiple drug resistance and screening of enterotoxin(stn)gene in Salmonellaenterica serovars from water sources in Lagos,Nigeria[J].Public Health,2011,125:65-71.

[22]王晶鈺，董睿.市售鮮雞蛋中沙門氏菌的分離鑒定及毒力島基因檢測[J].食品科學，2012，33(16)：154-158.

[23]Gerlach R.Salmonellapathogenicity island 4 encodes a giantnon-fimbrial adhesin and the cognate typeⅠsecretion system[J].Cellular Microbiol,2007,9(7):1834-1850.

[24]Knodler L.Salmonellaeffectors within a single pathogenicity island are differentially expressed and translocated by separate typeⅢsecretion systems[J].Mol Microbiol,2002,43(5):1089-1103.

[25]方艷紅，孫裴，魏建忠，等.沙門氏菌毒力基因研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2010，31(S)：190-193.

[26]Saroj S D,Shashidhar R.Distribution of Salmonellapathogenicity island (SPI-8)and SPI-10 among differentserotypesof Salmonella[J].J Medical Microbiol,2008,57:95-102.

[27]Schlumberger M,Hardt W.SalmonellatypeⅢsecretion effectors:pulling the host cell's strings[J].Current Opin Microbiol,2006,9(1):46-54.

[28]Main H K.Coordinate regulation of Salmonellapathogenicity island 1(SPI1)and SPI4 in Salmonella entericaserovar Typhimurium[J].Infect Immune,2008,76(3):1024-1030.

[29]Kong Wei,Weatherspoon N,Shi Yi-xin.Molecular mechanism for establishment of signal-dependent regulation in the PhoP/PhoQ system[J].J Biolog Chem,2008,283(24):16612.

[30]劉華偉，馬立農，郭藹光，等.具毒性質粒沙門氏菌的快速檢測[J].西北農業(yè)學報，2009，18(6)：382-384.

[31]焦旸，黃瑞.沙門菌屬質粒毒力基因spv的研究[J].國外醫(yī)學流行病學傳染病學分冊，2004，31(2)：119-124.