劉琴，陳芳，楊麗君，王麗平，朱以良，張宜

(解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，武漢 430070)

脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)來源于脂肪組織，具有自我更新、多向分化潛能、對自體損傷小、免疫原性弱、自體移植不發(fā)生排斥反應(yīng)等特點，是組織工程中最有應(yīng)用前景的種子細胞之一，特別是在骨組織再生利用中具有重要的意義[1-3]。兔脂肪間充質(zhì)干細胞是體外研究組織工程以及間充質(zhì)干細胞分化機制的常用間充質(zhì)干細胞之一。但是，如何獲得足量的兔脂肪間充質(zhì)干細胞，解決兔脂肪間充質(zhì)干細胞體外擴增、凍存及建立細胞庫等問題一直是學(xué)者們研究的重要內(nèi)容。目前，對于兔脂肪間充質(zhì)干細胞體外擴增、誘導(dǎo)分化的研究已經(jīng)較為詳盡，而對于兔脂肪間充質(zhì)干細胞低溫保存、復(fù)蘇方面的研究比較少。因此，本課題以兔脂肪間充質(zhì)干細胞為研究對象，探討低溫保存是否對兔脂肪間充質(zhì)干細胞的體外生長特性及多向分化潛能產(chǎn)生影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

普通級日本大耳白兔2只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供【SCXY(鄂)2011-0011】，實驗在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科進行【SYXK(鄂)2008-0007】。實驗過程中對動物的處置符合赫爾辛基宣言動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12、PBS購自Hyclone，F(xiàn)BS購自Gibco，MTT、DMSO購自Sigma，成脂、成骨誘導(dǎo)試劑盒購自Cyagen公司，F(xiàn)ITC-CD90、FITC-CD44、FITC-CD45及相應(yīng)的同型對照購自美國BD公司，ALP磷酸酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，通用細胞凍存液購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 兔脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)

參考文獻[4]。日本大耳白兔以10%的水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺上，手術(shù)區(qū)脫毛備皮，1%碘伏、75%醫(yī)用酒精依次消毒，鋪單，取股溝處的脂肪組織，移入超凈臺上，PBS漂洗3～4次，清除組織中肉眼可見的小血管、筋膜，剪碎至糜狀，將組織塊均勻地鋪在25 cm2玻璃細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。30 min后取出培養(yǎng)瓶，輕柔地加入2～3 mL含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基浸潤組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞生長情況，每3 d更換培養(yǎng)液，7～8 d時刮除組織塊。倒置顯微鏡動態(tài)觀察培養(yǎng)的兔脂肪間充質(zhì)干細胞生長形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化。待細胞達到80%～90%左右融合時用0.25% trypsin-EDTA進行1∶3傳代，記為第一代細胞(P1)。

1.2.2 細胞免疫表型的流式細胞分析

0.25% trypsin-EDTA消化收集對數(shù)生長期的第3代細胞，細胞計數(shù)，每管含5×105個細胞，800 r/min、2 min，棄上清，每管加入100 μL PBS重懸細胞，加入CD90、CD44、CD45抗體和相應(yīng)的同型對照10 μL，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2～3次，用流式細胞儀檢測。

1.2.3 細胞的凍存復(fù)蘇及復(fù)蘇率的檢測

取經(jīng)形態(tài)學(xué)和細胞免疫表型鑒定的第3代細胞，常規(guī)方法消化，收集細胞懸液，計數(shù)，每支細胞含量1×106個，1000 r/min、2 min，去上清后加入通用細胞凍存液，將凍存管置4℃ 1 h，-20℃ 2 h，再置 -80℃ 過夜，第2天放入-196℃液氮保存，6個月后取出凍存管，在37℃水浴箱中快速解凍，接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入適量DMEM/F12，6 h后換液，待細胞達80%～90%融合時以1∶3進行常規(guī)傳代。同時取復(fù)蘇后部分細胞，制成單細胞懸液，用臺盼藍染色計數(shù)，計算細胞活力，活率=活細胞總數(shù) /細胞總數(shù)×100%，共3次，取3次平均值。

1.2.4 MTT繪制生長曲線

將實驗分為兩組，實驗組為凍存6個月復(fù)蘇后傳至第7代的細胞(P7)，調(diào)整細胞密度為1×104/mL，接種到96孔板(每孔200 μL)，并設(shè)調(diào)零孔和對照孔，連續(xù)測8d；對照組為未經(jīng)低溫凍存的第7代細胞，以相同的細胞密度接種到96孔板。從接種后的第2天起，每天同一時間取樣，用PBS沖洗1～2次，各滴加50 μL MTT溶液(5g/L)，37℃孵育4 h后吸棄各孔內(nèi)的液體，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔吸光值，計算出各組的均值，以時間(d)為橫坐標(biāo)，吸收值(A) 為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.5 細胞分化潛能的檢測

根據(jù)成脂、成骨分化誘導(dǎo)試劑盒說明書介紹的方法，實驗組與對照組分別進行體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化實驗，誘導(dǎo)2周后分別進行油紅O染色、茜素紅染色。

1.2.6 ALP 活性測定

實驗組與對照組細胞分別成骨誘導(dǎo)3、5、7、9、11、13、15、17 d，取每組4孔細胞，按ALP試劑盒檢測各組細胞的堿性磷酸酶活性，檢測結(jié)果單位換算為 U/104個細胞。堿性磷酸酶活性為金氏單位/g，換算公式為每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個金氏單位，參考文獻[5]。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用 SPSS 10.01 統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對t檢驗，P值< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔脂肪間充質(zhì)干細胞的生長特性

將組織塊接種到培養(yǎng)瓶2～3 d后，可見少量細胞從組織塊中爬行出來，形態(tài)以長梭形為主，少數(shù)為圓形、多角形。培養(yǎng)3～4 d后，在光鏡下可見更多的細胞從組織塊中爬行出來，細胞大小比較均一，形態(tài)多為典型的長梭形，見圖1A。12～14 d后，細胞數(shù)量明顯增多，細胞形態(tài)變?yōu)榫坏拈L梭形，并達到80%左右融合，見圖1B。細胞傳至第3代時，可見大量成纖維細胞樣的細胞呈明顯的漩渦狀生長，見圖1C(圖1見彩插9)。

2.2 細胞免疫表型的分析

流式細胞儀分析第3代細胞的細胞表型，檢測結(jié)果顯示：培養(yǎng)的細胞強烈表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)的標(biāo)志物CD44、CD90，陽性率分別達97.60%、99.96%；低表達造血干細胞相關(guān)的標(biāo)志物CD45，陽性率低于0.19%，見圖2。表明分離培養(yǎng)的細胞是具有均一間充質(zhì)干細胞表面特征的細胞群。

圖2 流式細胞儀檢測第3代兔脂肪間充質(zhì)干細胞細胞表型

2.3 兔脂肪間充質(zhì)干細胞凍存復(fù)蘇培養(yǎng)觀察

取凍存6個月的第3代兔脂肪間充質(zhì)干細胞復(fù)蘇，臺盼蘭染色后細胞存活率可達83%。復(fù)蘇的細胞6 h內(nèi)貼壁，少許懸浮，貼壁細胞以長梭形為主，生長狀態(tài)良好，5～6 d達到80%～90%融合，與凍存前兔脂肪間充質(zhì)干細胞在形態(tài)上無明顯差別，見圖3(彩插9)。傳代后細胞增殖速度較快，形態(tài)較均一，以長梭形為主。

2.4 生長曲線

采用MTT法繪制凍存前后兔脂肪間充質(zhì)干細胞的生長曲線，兩組均呈典型的“S”形，接種細胞經(jīng)2天左右的潛伏期后在第4天進入對數(shù)生長期，隨著培養(yǎng)時間的增加而增殖，在第7天進入平臺期，凍存后兔脂肪間充質(zhì)干細胞的增殖能力與凍存前沒有顯著差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 兔脂肪間充質(zhì)干細胞凍存前后細胞的生長曲線

2.5 油紅O染色

為鑒定復(fù)蘇兔脂肪間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞的分化能力，取復(fù)蘇后傳代至第7代的細胞及未凍存的第7代兔脂肪間充質(zhì)干細胞，做成細胞爬片，加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)3～4d后少量細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎嘟切巍⒉灰?guī)則形。誘導(dǎo)5～6 d后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量的脂滴。10～12d時細胞形態(tài)以多角形、不規(guī)則形為主，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。2周時油紅O染色，兩組細胞內(nèi)均出現(xiàn)大量紅染顆粒，見圖5(彩插9)。表明凍存復(fù)蘇的兔脂肪間充質(zhì)干細胞可被誘導(dǎo)為脂肪細胞。

2.6 茜素紅染色

為鑒定復(fù)蘇兔脂肪間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化能力，取復(fù)蘇后傳代至第7代的細胞及未凍存的第7代兔脂肪間充質(zhì)干細胞，做成細胞爬片，加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)5～6d后，可見細胞部分形態(tài)由長梭形變?yōu)椴灰?guī)則形、類圓形、多角形。10～12d后可見不規(guī)則形、多角形細胞堆積，呈明顯的簇狀生長。2周時小心吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定后加入茜素紅染色，兩組細胞均可見桔紅色的鈣結(jié)節(jié)，見圖6(彩插9)。表明復(fù)蘇凍存后的兔脂肪間充質(zhì)干細胞可被誘導(dǎo)為成骨細胞。

2.7 堿性磷酸酶活性測定

凍存后兔脂肪間充質(zhì)干細胞的堿性磷酸酶表達活性存在明顯的變化趨勢。成骨誘導(dǎo)1 d時即可檢測到低水平表達的堿性磷酸酶，3 d后堿性磷酸酶值開始持續(xù)增加，13 d左右達到峰值，之后緩慢下降，與凍存前兔脂肪間充質(zhì)干細胞堿性磷酸酶表達變化趨勢無顯著差異(P>0.05)，見圖7。

圖7 凍存前后后兔脂肪間充質(zhì)干細胞的堿性磷酸酶活性

3 討論

體外獲得足夠量的、生物學(xué)性狀穩(wěn)定的兔脂肪間充質(zhì)干細胞是其應(yīng)用于骨組織工程[6-8]，以及脂肪間充質(zhì)干細胞成骨機制[9]、成軟骨機制[10]等研究的先決條件。但兔脂肪間充質(zhì)干細胞隨著傳代時間的增加，其增殖、分化能力均逐漸下降；另一方面，若同一課題組不同研究者要進行長期的、連續(xù)的實驗，則需重新分離細胞，浪費動物和經(jīng)費，限制兔脂肪間充質(zhì)干細胞的廣泛應(yīng)用。低溫凍存是長期保存細胞的重要方法，可在一定程度上彌補以上不足之處。

本實驗采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)兔脂肪間充質(zhì)干細胞，細胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈典型的成纖維樣。關(guān)于脂肪間充質(zhì)干細胞的分子特征，目前尚無研究發(fā)現(xiàn)它有特異性的細胞表型標(biāo)志物，并且不同的研究結(jié)果有著不同的說法。Gronthos[11]及Gu等[12]認(rèn)為人脂肪間充質(zhì)干細胞表達CD34。但是，Zuk等[13]和Dominici等[14]的研究結(jié)果與之相反。Yoshimura等[15]認(rèn)為脂肪間充質(zhì)干細胞表達CD34、CD90，不表達CD31、CD45、CD106、CD146。而Varma MJ等[16]認(rèn)為脂肪間充質(zhì)干細胞表達CD34、CD54、CD90、CD105、CD117、HLA-ABC、HLA-DR，陰性表達CD31、CD45、CD106、CD146、CD166。Lindroos等[17]及Baer等[18]認(rèn)為供體的不均勻性、脂肪間充質(zhì)干細胞的體外分離方法與抗體的來源、抗體的質(zhì)量、檢測方法的敏感性、細胞培養(yǎng)的條件、鑒定細胞的代數(shù)可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因。實驗選用具有鑒別意義的細胞表型標(biāo)記物CD90、CD44、CD45作為兔脂肪間充質(zhì)干細胞的表型鑒定[19]，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，第3代細胞高表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)的表面抗原CD44、CD90，陽性率超過90%；不表達造血細胞相關(guān)的表面抗原CD45，陽性率低于1%，與文獻[20]報道的研究結(jié)果基本一致。

二甲基亞砜是細胞凍存液的主要成分， 是一種重要的滲透型細胞保護劑。二甲基亞砜能夠降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，在緩慢降溫過程中，可使細胞內(nèi)水分滲出細胞外，防止細胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷。復(fù)蘇時1～2 min內(nèi)復(fù)溫，可使細胞外結(jié)晶在短時間內(nèi)融化，避免細胞內(nèi)再形成結(jié)晶[21]。將第3代經(jīng)形態(tài)學(xué)及表面抗原鑒定的兔脂肪間充質(zhì)干細胞凍存于液氮中，6個月后復(fù)蘇，復(fù)蘇率達83%，復(fù)蘇的細胞貼壁快，生長狀態(tài)良好，5～7 d達到80%～90%融合，細胞形態(tài)以長梭形為主。傳代后，細胞的生長曲線呈典型的“S”形。凍存后細胞的形態(tài)、生長曲線與凍存前不存在明顯的差別，表明低溫凍存不會影響兔脂肪間充質(zhì)干細胞的自我更新和增殖能力。

為證實凍存復(fù)蘇多次傳代后的兔脂肪間充質(zhì)干細胞仍具有向脂肪細胞、成骨細胞分化的能力，對凍存復(fù)蘇傳代至第7代及未凍存的第7代兔脂肪間充質(zhì)干細胞分別進行成脂、成骨誘導(dǎo)。脂滴是成脂誘導(dǎo)過程中形成的特異性物質(zhì)。細胞外基質(zhì)鈣化是骨組織礦化的標(biāo)志，是成骨分化的終末期表現(xiàn)[22]。堿性磷酸酶是成骨過程中分泌的特異性蛋白質(zhì)，其高表達是成骨細胞早期分化的特異性標(biāo)志[23-24]。實驗針對以上指標(biāo)進行了驗證，結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)的凍存前后的兔脂肪間充質(zhì)干細胞油紅O染色為陽性。成骨誘導(dǎo)的凍存前后的兔脂肪間充質(zhì)干細胞茜素紅染色為陽性，細胞堿性磷酸酶活性均隨著時間的增加明顯升高，且凍存前后細胞的堿性磷酸酶活性無顯著差異(P>0.05)，表面凍存復(fù)蘇多次傳代后的兔脂肪間充質(zhì)干細胞具有向脂肪細胞、成骨細胞分化的潛能，與報道的凍存復(fù)蘇多次傳代后的臍帶間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能相符合[25]。

綜上述，低溫凍存可作為長期保存兔脂肪間充質(zhì)干細胞的一種有效方法，凍存復(fù)蘇傳代后的兔脂肪間充質(zhì)干細胞保持著干細胞的生物活性，具有較強的增殖能力和向脂肪細胞、成骨細胞分化的能力，為今后建立兔脂肪間充質(zhì)干細胞庫以及兔脂肪間充質(zhì)干細胞在組織工程、疾病、干細胞分化機制等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

(本文圖1,3,5,6見彩插9。)

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