馬曉麗，駱新，盧偉，李琳琳， 王燁，毛新民

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1.分析測(cè)試中心； 2.基礎(chǔ)學(xué)院藥理教研室； 3.中醫(yī)學(xué)院；烏魯木齊 830011)

高血壓是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所致的一種多基因和多因素的復(fù)雜性疾病，也是2 型糖尿病，心血管疾病、中風(fēng)的危險(xiǎn)因子，但其病因目前尚不清楚。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者采用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)研究其發(fā)病機(jī)制，但結(jié)果并不十分理想。代謝組學(xué)可從整體水平研究機(jī)體受內(nèi)源和外源刺激后小分子代謝物的變化規(guī)律，揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。因此，在高血壓病的發(fā)病機(jī)制闡述上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)是目前國(guó)際上公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，本研究欲通過(guò)核磁共振氫譜技術(shù)對(duì)高血壓大鼠尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，通過(guò)PLS-DA方法尋找高血壓大鼠模型不同階段尿液的代謝譜變化，探索代謝組學(xué)在高血壓研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

11周齡的SPF級(jí)雄性SHR大鼠6只，同周齡雄性Wistar大鼠8只，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，晝夜明暗交替時(shí)間12h/12h，溫度(21±2)℃，濕度45%～55%。

將雄性SHR大鼠和Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)兩天測(cè)量大鼠血壓,同時(shí)收集尿液。8只Wistar大鼠為空白組。SHR大鼠作為模型組，兩組喂食普通飼料，自由進(jìn)水。

1.2 試劑與儀器

低溫超速離心機(jī)：美國(guó)Beckman 公司；Inova600型核磁共振波譜儀：美國(guó)Varian 公司；-80℃超低溫冰箱：中國(guó) 海爾公司；重水(Cambridge Isotope Laboratories,Inc產(chǎn)品)；NaCI、K2HPO4、NaH2PO4(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所 )，TSP,核磁管，蒸餾水。

1.3 收縮壓(SBP)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用采用BP-98A無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)每5 d測(cè)量血壓一次。操作時(shí)，先將大鼠裝進(jìn)保溫套中加熱5 min 左右，連續(xù)測(cè)量5～6次，取收縮壓(SBP)平均值為該大鼠的血壓值。比較兩組大鼠血壓變化。

1.4 尿液標(biāo)本收集處理

分別于造模后 1、2、3、4周末，代謝籠中收集12 h大鼠尿液，-80℃ 冰箱保存。尿液代謝譜測(cè)定方法: 每個(gè)尿液樣本各取400 μL,每個(gè)樣本加入200 μL重水配制的磷酸緩沖液中，室溫放置10 min，以10 000 r/min離心10 min,取上清液550 μL放入5 mm核磁管中。用Inova600兆核磁共振波譜儀調(diào)用Noesy-Presat-1D (RD-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition) 脈沖序列進(jìn)行氫譜測(cè)定。對(duì)1H核共振頻率為500.13 MHz，累積掃描64次，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)32 768，譜寬20 mg/L，采樣延遲2 s，每次掃描時(shí)間均為1.64 s，測(cè)試溫度25℃，采用預(yù)飽和方法壓制水峰。

1.5 圖譜處理和數(shù)據(jù)分析

尿液1H核磁共振圖譜(1H-NMR譜)進(jìn)行基線及相位調(diào)整后選擇H為10.0～0.5 ppm的區(qū)域進(jìn)行自動(dòng)積分,積分區(qū)間設(shè)為0.003 ppm。為了消除飲水量對(duì)代謝物濃度的影響,積分值進(jìn)行歸一化處理(每一段積分值除于所有積分值之和)。用SMICA-P+軟件進(jìn)行最小方差判別分析法(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)。

PLS-DA主要用于觀察各組樣本是否有差異性,而兩組中具有差異性的積分段的判斷則用OPLS-DA。通過(guò)OPLS-DA獲得的每一個(gè)積分段所代表的代謝物相關(guān)系數(shù)(r)來(lái)確定不同組尿液中的差異性代謝成分,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P=0.05。在本研究中,根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測(cè)(Pearson′s product moment correlation coefficient)確定|r|大于0.707(樣品數(shù)n=6)所代表的代謝物是統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)的代謝物臨界值。|r|值越大表示差異性越大,反之越小。

2 結(jié)果

2.1 SHR模型確證

由表1可知,SHR和Wistar大鼠在SBP上有顯著的差異,SHR的平均SBP均超過(guò)190 mmHg,遠(yuǎn)高于Wistar大鼠的血壓,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 SHR和Wistar大鼠尿液的代謝特征比較

2.2.1 模型組與對(duì)照組代謝模式的比較

NMR分析得到的譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)提取和前處理得到的矩陣在 SIMCA-P 軟件中進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，采用有監(jiān)督的 PLS-DA 方法，對(duì)動(dòng)物樣本進(jìn)行分組處理。從結(jié)果看出，模型組與對(duì)照組的代謝輪廓譜在 1 周、2 周、3 周、4周后有清晰的區(qū)分，說(shuō)明高血壓大鼠在代謝特征上與正常大鼠存在著差異(圖 1 A、B)。

為了更加直觀地將正常大鼠在喂養(yǎng)過(guò)程以及模型大鼠在成模后代謝模式的變化呈現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組和模型組大鼠尿樣的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)的分析。結(jié)果表明，對(duì)照組動(dòng)物在喂養(yǎng)的過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，高血壓模型大鼠代謝模式則呈現(xiàn)規(guī)律性變化，隨時(shí)間變化不明顯，說(shuō)明SHR高血壓大鼠有著特定的代謝模式(圖 2)。

表1 SHR和Wistar大鼠的血壓比較±s)

圖1 為SHR和Wistar大鼠尿液樣品典型的NMR圖譜(A 正常大鼠，B高血壓大鼠)

注：A：造模1周后； B：造模2周； C： 造模3周； D：造模4周。

2.2.2 樣本的 OPLS-DA 分析

為了更好的反應(yīng)高血壓病理狀態(tài)下產(chǎn)生的差異，試驗(yàn)中采用了正交偏最小方差―判別分析(OPLS-DA 分析)。通過(guò)這種監(jiān)督的方法建立的模型，可以找到對(duì)模型影響較大的代謝物變量，而這些代謝物有利于對(duì)高血壓大鼠模型發(fā)生機(jī)制做深入的理解。

本實(shí)驗(yàn)選擇了區(qū)分度最好的第3周的樣品進(jìn)行 OPLS-DA 的代謝模式比較。對(duì)照組大鼠與模型組大鼠尿液代謝物有著很好的區(qū)分，并且分析了差異變量 (見(jiàn)表2)。

表2 尿液代謝譜中主要代謝物的變化

3 討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在適應(yīng)性喂食一周后高血壓大鼠模型組與對(duì)照組大鼠的尿液代謝譜即有明顯差異; 在隨后的4周中，分別收集兩組大鼠的尿液進(jìn)行核磁共振代謝譜的比較，發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組之間的代謝輪廓趨勢(shì)非常穩(wěn)定，能明顯分離，說(shuō)明高血壓大鼠尿液的生理模式有其固定的規(guī)律并且與正常大鼠不同，表明尿液的代謝譜中可能包含有高血壓的病理變化信息。為了確定自發(fā)性高血壓大鼠相關(guān)的代謝物，選取第三周尿液樣本進(jìn)行OPLS-DA 的代謝模式比較，通過(guò)相關(guān)系數(shù)找出了多個(gè)差異變量。

由于尿液是一種含有許多內(nèi)源性化合物的復(fù)雜體液,因此利用高通量、高靈敏的分析手段結(jié)合模式識(shí)別可以區(qū)分疾病模型和正常個(gè)體,找出區(qū)分兩者的內(nèi)源性化合物,建立疾病經(jīng)典指標(biāo)與代謝組學(xué)中生物標(biāo)志物的關(guān)系,從而為研究發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究表明:在SHR模型大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)多種氨基酸的濃度顯著高于正常對(duì)照大鼠,包括亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和一些有機(jī)酸(如丙酸)的表達(dá)水平在模型組中都有上升?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，肌肉及肝中蛋白質(zhì)合成減少而分解增多，血漿及尿液中氨基酸增多所致。

另外，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到一些小分子代謝物，如甜菜堿、肌酸酐、鯊肌醇等含量在模型組顯著升高甜菜堿主要是由食物經(jīng)過(guò)腸道內(nèi)的菌群代謝而產(chǎn)生，代謝的母體主要是食物中的多酚和食物蛋白分解出來(lái)的一些芳香族的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等，表明高血壓大鼠的腸道內(nèi)的菌群代謝可能發(fā)生紊亂。對(duì)這些內(nèi)源性化合物代謝通路的進(jìn)一步分析，對(duì)于深入研究糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制有著極其重要的意義。

[1] Lindon JC,Holmes E,Nicholson JK.So what’s the deal with the metabonomics [J].Anal Chem,2003,75(17 ):384A-391A.

[2] Lindon JC,Holmes E,Nicholoson JK,et al.Metabonomics technologies and their applications in physiological monitoring,drug safety assessment and disease diagnosis [J].Biomarkers,2004,9:1-31.

[3] 陸益紅,王廣基,黃青,等.自發(fā)性高血壓大鼠血漿代謝組學(xué)研究及人參總皂苷作用機(jī)制初探 [J].中國(guó)天然藥物,2007,5(6):443-446.

[4] 袁琳,白永生,周明眉,等.2 型糖尿病大鼠的尿液代謝組學(xué)改變 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào).2011,19(2):111-114.

[5] 蔣海強(qiáng),馬斌,聶磊,等.高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者尿液樣品的核磁共振譜代謝組學(xué)研究 [J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,35(5):662-665.

[6] 帕麗丹·吾術(shù)爾.老年癡呆異常黑膽質(zhì)病證結(jié)合模型的建立及異常黑膽質(zhì)成熟劑的干預(yù)研究[D].新疆醫(yī)科大學(xué)博士論文，2013年.

[7] 邱云平.基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的大腸癌代謝組學(xué)研究[D].上海交通大學(xué)博士論文，2013年.