韓云竹，宋 鴻

(遵義醫(yī)學院 微生物學教研室，貴州 遵義 563099)

肝癌是我國常見腫瘤之一，由于進展較快、預后較差，每年有數十萬人死于肝癌[1]。目前對肝癌的生物學性狀及藥物敏感性研究多采用單層細胞培養(yǎng)法，但單層培養(yǎng)存在較多局限性，可導致癌細胞生物學性狀的缺失或改變[2]，有研究表明單層培養(yǎng)所揭示的細胞耐藥機制也與體內耐藥機制存在一定的差異性[3]。而三維培養(yǎng)通過構建細胞和材料的三維空間復合體，模擬細胞在體內形成的組織樣結構、細胞間的相互聯(lián)系、細胞與基質間的相互作用等特征[4]，在一定程度上彌補了單層培養(yǎng)的不足，對肝癌細胞的體外研究將更為理想。近年來，從天然褐藻中提取的藻酸鹽由于不受溫度控制、凝膠較易塑形、材料易得、價格便宜，且具有良好的生物相容性和生物可降解性[5]，在細胞三維培養(yǎng)中得到了廣泛應用[6-7]。本研究采用藻酸鹽為立體支

架進行肝癌HepG2細胞的三維培養(yǎng)，通過觀察細胞在該材料中的形態(tài)及生長情況，為其應用于肝癌組織工程研究及抗癌藥物篩選提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 HepG2細胞株為遵義醫(yī)學院微生物學教研室保存；DMEM高糖型培養(yǎng)基(Gibco公司)；藻酸鹽、鈣黃綠素-碘化丙啶、四甲基偶氮唑鹽、胰蛋白酶(Sigma公司)；DMSO、氯化鈣(國產分析純)；酶標儀(上海三科儀器有限公司，318-C型)；倒置顯微鏡及顯微攝影系統(tǒng)(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 藻酸鹽溶液的制備 用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)配制2%的藻酸鹽溶液，常溫下磁力攪拌器攪拌4～6 h，充分溶解后用0.22μm的濾器過濾除菌。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞在凝膠中的培養(yǎng) 將HepG2細胞接種于培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合達80%后，用0.25%胰酶消化離心，細胞計數，調整細胞懸液濃度為1×106/mL；加入等量2%的藻酸鹽溶液，充分混勻，將藻酸鹽凝膠細胞混合懸液滴入自制模具中，以102 mmol/LCaCl2溶液處理，形成藻酸鈣凝膠后取出模具，加入培養(yǎng)液洗滌2次，懸于培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，每48小時換液1次。定期在倒置顯微鏡下觀察凝膠中HepG2細胞的生長情況。

1.2.3 組織學觀察 于三維培養(yǎng)的第1、5、10天取細胞凝膠復合物PBS漂洗3次，經4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片3 μm，HE染色后光鏡下觀察。

1.2.4 鈣黃綠素-碘化丙啶染色 在三維培養(yǎng)的第1、5、10天，取部分標本，預冷PBS潤洗3次，15 min/次。依次加入鈣黃綠素-碘化丙啶染液，避光、室溫孵育45 min，熒光顯微鏡下觀察，鈣黃綠素被活細胞胞漿內酯酶活化發(fā)出綠色熒光，碘化丙啶與死細胞的細胞核結合發(fā)出紅色熒光。

1.2.5 MTT法檢測凝膠內細胞增殖情況 將細胞凝膠復合物接種于24孔板中進行培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的1、3、5、7 d取樣測定，PBS洗滌3次后加入55 mmol/L檸檬酸鈉使其溶解，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL孵育4 h，吸棄液體，用1 mL DMSO溶解結晶，吸取200 μL于96孔板中，酶標儀492 nm處測吸光度值。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察 二維培養(yǎng)細胞4h后開始貼壁，24h完全貼壁，細胞呈多邊形，大小較均一，見圖1A，培養(yǎng)第2天細胞匯合達80%。與二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)的細胞在藻酸鹽凝膠中懸浮生長，增殖相對較慢，第5天才開始相互聚集并增殖成團，呈葡萄串狀，隨培養(yǎng)時間的延長細胞團體積逐漸增大，細胞數量逐漸增多，形成較大的細胞聚集體，且整個培養(yǎng)過程中細胞均呈圓形或球形，見圖1B-D。

注：A:二維培養(yǎng)；B:三維培養(yǎng)第1天；C:三維培養(yǎng)第5天；D:三維培養(yǎng)第10天。 圖1 倒置顯微鏡觀察二維及三維培養(yǎng)細胞(×100)

2.2 組織學觀察 如圖2所示，藻酸鹽凝膠內培養(yǎng)第1天，細胞為單個生長，胞核大而圓；第5天開始逐漸增殖為2～3個細胞組成的的單個小細胞團，胞核清晰藍染，胞質染色較淡；至第10天，形成較大緊密團狀細胞球，表明細胞在凝膠內生長狀態(tài)較好。

注：A:三維培養(yǎng)第1天；B:三維培養(yǎng)第5天；C:三維培養(yǎng)第10天。 圖2 三維培養(yǎng)HepG2細胞(HE×200)

2.3 三維培養(yǎng)細胞熒光染色觀察 經鈣黃綠素-碘化丙啶染色后(見圖3)，可見三維培養(yǎng)第1至第10天的細胞逐漸成團，且絕大部分發(fā)出綠色熒光，未見紅色熒光，提示藻酸鹽凝膠內HepG2細胞生長活性良好。

注：A:三維培養(yǎng)第1天；B:三維培養(yǎng)第5天；C:三維培養(yǎng)第10天。圖3 三維培養(yǎng)細胞熒光染色(×100)

2.4 MTT法測細胞增殖 HepG2細胞在藻酸鹽凝膠中的增長情況見圖4。培養(yǎng)初期生長緩慢，第5天開始細胞進入快速增長期，提示細胞在凝膠內保持活躍的增殖狀態(tài)。

圖4 HepG2細胞在藻酸鹽凝膠中的增殖情況

3 討論

目前組織工程研究中使用的支架材料有很多，主要包括天然可降解材料如膠原蛋白、藻酸鹽、殼聚糖等和人工合成可降解材料如PLLA、PLGA、PLLA-PLGA共聚物等[8-9]。人工合成可降解材料雖然生產重復性好，可預先設計和控制材料的精細結構、降解時間，但材料在生物相容性、理化性能、降解速率等方面仍有許多問題尚待解決[10]。相比之下來源于動植物或人體的天然生物材料因具有良好的生物相容性、可降解性，且降解產物無毒，在組織工程中得到了廣泛應用，其中水凝膠材料如Matrigel、膠原蛋白、藻酸鹽等因其可注射性等特點受到重視[11-12]。Matrigel和膠原蛋白常用于腫瘤細胞三維培養(yǎng)，有研究表明這兩種材料所構建的三維培養(yǎng)體系均有利于細胞的增殖和分化[13];但由于它們多來源于動物，因此有潛在的動物源性病原體存在，同時它們的價格比較昂貴，且屬于溫敏型材料，在實驗過程中對溫度要求較高，使得實驗操作難度加大。而藻酸鹽是從海藻中提取的一種天然高分子聚合物，極易和二價陽離子如Ca2+作用形成水凝膠。與溫敏型材料相比，藻酸鹽的成膠過程不受溫度影響，使得實驗操作更加簡單，同時由于藻酸鹽具有高度多孔結構及親水特性，使得營養(yǎng)物質易于滲透，因此藻酸鹽在三維培養(yǎng)中得到廣泛的應用[6，12-13]。

本實驗采用藻酸鹽凝膠培養(yǎng)體系進行肝癌HepG2細胞的三維培養(yǎng)，通過組織學、鈣黃綠素-碘化丙啶染色及MTT實驗觀察細胞的形態(tài)及生長情況。結果發(fā)現，藻酸鹽凝膠內的HepG2細胞在培養(yǎng)初期表現為圓形或球形，增殖并不活躍，培養(yǎng)至第5天細胞開始出現快速增殖，并聚集形成細胞團，說明藻酸鹽凝膠培養(yǎng)體系適宜于肝癌細胞的體外培養(yǎng)，是一種較為理想的肝癌細胞載體。與傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)相比，雖然三維培養(yǎng)細胞增殖出現較晚，且這種生長方式在一定程度上限制了細胞的生長代謝，但細胞的活性卻能長期維持，有利于細胞合成、分泌等功能的發(fā)揮；同時細胞在凝膠內呈團狀生長，增加了細胞間的接觸，有利于細胞與細胞、細胞與支架之間發(fā)生相互作用。本研究肝癌細胞藻酸鹽凝膠三維培養(yǎng)體系的成功建立，為今后體外深入研究肝癌發(fā)病機制、耐藥機理提供了重要的實驗依據。

[參考文獻]

[1] Aravalli R N.Progress in stem cell-derived technologies for hepatocellular carcinoma[J].Stem Cells Cloning, 2010, 3:81-92.

[2] Grun B, Benjamin E, Sinclair J, et al. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer[J]. Cell Prolif, 2009, 42(2): 219-228.

[3] Fischbach C, Kong H J, Hsiong S X, et al. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2009, 106(2): 399-404.

[4] Loessner D, Stok K, Lutolf M, et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of eptithelial ovarian cancer cells[J].Biomaterials,2010,31(32):8494-8506.

[5] Masuda K, Sah R L, Hejna M J. A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: the alginate-ecovered- hondrocyte (ARC) method [J]. J Orthopaedic Res, 2003, 21(1):139-148.

[6] 宋鴻，陳煒. 兔關節(jié)軟骨細胞在藻酸鹽凝膠中體外培養(yǎng)[J]. 遵義醫(yī)學院學報，2009，32(1)：20-23.

[7] Darilis S, Kara B, Eiji S, et al. Controlled nucleation of hydroxyapatite on alginate for stem cell-based bone tissue engineering[J]. J Biomed Mater Res A,2010, 95(1): 222-234.

[8] Gelain F, Bottai D, Vescovi A, et al. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures[J]. PLoS ONE,2006, 1:e119.

[9] Bokhari M, Camachan R J, Cameron N R,et al. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function[J]. BiochemBiophys Res Commun, 2007, 354(4):1095-1100.

[10] Plieva F M, Galaev I Y, Mattiasson B.Macroporous gels prepared at subzero temperatures as novel materials for chromatography of particulate-containing fluids and cell culture applications[J].J Sep Sci, 2007, 30(11):1657-1671.

[11] Philp D, Chen S S, Fitzgerald W, et al. Complex extracellular matrices promote tissue-specific stem cell differentiation[J]. Stem Cells, 2005, 23(2):288-296.

[12] Andriamanalijiaona R, Duval E, Raoudi M. Differentiation potential of human muscle-derived cells towards chondrogenic phenotype in alginate beads culture[J].Osteoarthritis Cartilage, 2008, 16(12): 1509-1518.

[13] Mondrinos M J, Koutzaki S, Jiwanmall E, et al. Engineering three-dimensional pulmonary tissue constructs[J]. Tissue Eng, 2006, 12(4):717-728.