何 亮,康亞輝,黃厚今,王忠明

(1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099; 2.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院暨蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院，江蘇 連云港 222000)

穿心蓮內(nèi)酯是天然植物穿心蓮的主要有效成分，本品為二萜內(nèi)酯類化合物，難溶于水，具有清熱祛毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、治療心腦血管疾病、抗腫瘤、抗糖尿病及抗生育等作用[1]。穿心蓮內(nèi)酯在抗腫瘤方面已有研究顯示，可顯著抑制食管癌細(xì)胞Ec9706的增殖，并通過激活caspase3通路促使細(xì)胞凋亡[2]。另有研究證實(shí)，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和HCT-116及前列腺癌細(xì)胞PC-3均有明顯體外增殖抑制作用[3]。不同分化結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)穿心蓮內(nèi)酯增殖敏感性未見報(bào)道，本研究通過MTT法明確穿心蓮內(nèi)酯對(duì)不同分化結(jié)腸癌細(xì)胞株體外增殖影響，以期揭示穿心蓮內(nèi)酯對(duì)不同分化結(jié)腸癌的作用，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2(高分化)、HT-29(中分化)和Lovo(未分化)，均購于美國ATCC；穿心蓮內(nèi)酯購自南京植朗公司(純度>98%)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解， 配制成100 mg/mL的溶液， -20 ℃保存?zhèn)溆茫灰让?，DMEM培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，加入青霉素和鏈霉素，使其濃度分別為100U/mL和100μg/mL；胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO購自無錫海碩生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將3種細(xì)胞分別培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中， 置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育, 2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法 實(shí)驗(yàn)分為穿心蓮內(nèi)酯實(shí)驗(yàn)組、50 μg/mL 5-氟脲嘧啶(5-FU) 對(duì)照組、陰性對(duì)照組、0.2%DMSO對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組各設(shè) 6個(gè)復(fù)孔。其中藥物組包括 3.75 μg/mL、7.5 μg/mL、15 μg/mL 、30 μg/mL、60 μg/mL、120 μg/mL共6個(gè)濃度組，加藥前以DMEM完全培養(yǎng)基稀釋100 mg/mL穿心蓮內(nèi)酯溶液(DMSO溶解)為所需濃度；陰性對(duì)照組為正常培養(yǎng)組，用作其它實(shí)驗(yàn)組的參考值比較；空白對(duì)照組無細(xì)胞只含完全培養(yǎng)基，用于酶標(biāo)儀測(cè)值對(duì)照。調(diào)整細(xì)胞密度后取三塊96孔板分別接種細(xì)胞，100 μL/孔 (密度：5×104/mL)，待細(xì)胞貼壁后加藥處理，72 h組于48 h更換一次含藥培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加入20 μLMTT(5 mg/L) 37 ℃培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖床輕柔震蕩10 min。采用酶標(biāo)儀(A490nm/A630nm)檢測(cè)吸光度，腫瘤細(xì)胞抑制率(IR,%)=[1-( A490Sample-A490blank)/( A490control-A490blank)]×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 陰性組和DMSO組比較 由于穿心蓮內(nèi)酯用DMSO溶解，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同分化結(jié)腸癌細(xì)胞株在不同時(shí)間段的陰性組和DMSO組OD值進(jìn)行比較，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示兩組間OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

細(xì)胞系24hOD值陰性組DMSO組48hOD值陰性組DMSO組72hOD值陰性組DMSO組Caco-20.043±0.0040.044±0.0080.077±0.0110.096±0.0770.055±0.0140.053±0.016HT290.033±0.0250.044±0.0180.075±0.0350.066±0.0220.112±0.0130.129±0.015Lovo0.040±0.0140.034±0.0110.058±0.0060.050±0.010.068±0.0160.058±0.018

注：陰性組與DMSO組比較，*P<0.05。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)各分化結(jié)腸癌細(xì)胞株體外增殖的影響 IR值顯示了藥物對(duì)細(xì)胞的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，研究顯示，3種細(xì)胞隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，IR值均隨著增加，30 μg/mL濃度的穿心蓮內(nèi)酯作用細(xì)胞48 h后，Caco-2的抑制率約74%，HT-29的抑制率約88%，而Lovo的抑制率約為98%(見表2～4，圖1～3)。

分組 濃度μg/mLIR24h48h72h穿心蓮內(nèi)酯3.756.13±3.21*7.50±3.11*23.02±0.25*Φ#7.529.31±2.68*Δ35.63±2.23*Δ47.84±1.92*ΔΦ#1539.05±4.45*Δ57.08±3.0*ΔΦ68.09±1.58*ΔΦ#3068.33±1.08*Δ73.87±0.38*ΔΦ71.47±1.17*Φ6075.63±0.61*Δ78.09±1.42*Δ82.37±1.45*ΔΦ#12083.56±1.33*Δ85.51±0.84*Δ90.96±0.19*ΔΦ#5-FU對(duì)照組5015.09±0.59*55.17±2.74*Φ80.25±1.2*Φ#

注：與陰性組比較，*P<0.05；與前一濃度組比較，ΔP<0.05；與24 h組比較，ΦP<0.05；與48 h組比較，#P<0.05。

分組 濃度μg/mLIR24h48h72h穿心蓮內(nèi)酯3.7510.67±2.03*13.65±0.64*5.06±0.19*Φ#7.532.85±0.77*Δ49.37±4.01*ΔΦ40.30±4.09*Δ1542.09±3.69*Δ63.93±1.51*ΔΦ86.52±1.38*ΔΦ#3057.81±1.97*Δ87.58±2.99*ΔΦ96.98±0.68*ΔΦ#6067.02±1.95*Δ92.91±0.41*ΔΦ98.90±1.56*Φ#12071.79±0.72*95.33±0.6*Φ98.60±0.13*Φ#5-FU對(duì)照組507.50±0.28*26.77±2.74*Φ48.07±0.75*Φ#

注：與陰性組比較，*P<0.05；與前一濃度組比較，ΔP<0.05；與24h組比較，ΦP<0.05；與48h組比較，#P<0.05。

分組 濃度μg/mLIR24h48h72h穿心蓮內(nèi)酯3.7518.66±2.32*54.57±5.84*Φ52.42±6.05*Φ7.554.07±7.45*Δ81.98±2.94*ΔΦ86.59±2.69*ΔΦ1565.13±4.72*Δ91.24±3.19*ΔΦ96.99±1.12*ΔΦ3078.33±1.31*Δ97.73±0.75*Φ99.20±0.43*Φ6082.64±0.49*99.05±1.34*Φ99.65±0.49*Φ12086.75±0.63*99.56±0.19*Φ99.88±0.17*Φ5-FU對(duì)照組5043.62±1.25*54.16±0.76*Φ86.84±0.94*Φ#

注：與陰性組比較，*P<0.05；與前一濃度組比較，ΔP<0.05；與24 h組比較，*P<0.05；與48 h組比較，*P<0.05。

圖1 Caco-2細(xì)胞抑制率曲線 圖2 HT29細(xì)胞抑制率曲線 圖3 Lovo細(xì)胞抑制率曲線

2.3 不同分化結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)穿心蓮內(nèi)酯敏感性比較 對(duì)3種細(xì)胞不同時(shí)間段IC50值的分析顯示，48h組與24h組比較IC50值明顯降低(P<0.05)，HT-29和Lovo的IC50值甚至降低3倍，但3種細(xì)胞72 h組與48 h組比較，IC50值均未明顯降低(P>0.05)；24 h和48 h組相同時(shí)間段不同細(xì)胞IC50值比較可見，Lovo值最小，Caco-2值最高，HT-29介于兩者之間(見表5，圖4)。

細(xì)胞系24 h48 h72 hCaco-222.970±2.99314.261±1.96913.007±0.619HT2927.044±3.0189.969±0.8159.463±0.301Lovo9.961±0.0042.939±0.0812.528±0.353

圖4 3種細(xì)胞IC50值比較

3 討論

結(jié)腸癌是消化道腫瘤中5年生存率較低的疾病之一，僅為62%[4]。研究顯示，近些年青年人大腸癌發(fā)病率不但出現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)，而且與中老年人相比具有分化程度高，轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差等特點(diǎn)[5]。目前，結(jié)腸癌治療還沒有有效治療手段，主要采取手術(shù)治療，及術(shù)后輔以化療和放療，但預(yù)后效果均不佳，尤其分化程度較低腫瘤，因此尋求新的治療渠道和治療藥物成了近來研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的研究，為治療結(jié)腸癌尋求新的藥物。

藥物對(duì)癌細(xì)胞抑制率(IR)的高低，不僅可以顯示其對(duì)癌癥治療效價(jià)的高低，而且代表了藥物對(duì)癌細(xì)胞毒性的強(qiáng)弱。半數(shù)抑制率(IC50)是反應(yīng)化療藥物對(duì)癌細(xì)胞敏感性的指標(biāo)之一，通過等比濃度藥物作用癌細(xì)胞后產(chǎn)生的IR值，計(jì)算可得IC50值，其值越小，表示敏感性越高。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組含DMSO 0.2%，穿心蓮內(nèi)酯最高濃度120μg/mL僅含DMSO 0.12%，而通過DMSO組與陰性組均值的比較(P>0.05)，排除了用DMSO溶解穿心蓮內(nèi)酯對(duì)癌細(xì)胞的影響，進(jìn)而對(duì)各實(shí)驗(yàn)組做進(jìn)一步分析。

實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析顯示，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)不同分化結(jié)腸癌細(xì)胞株均有明顯體外增殖抑制作用，但對(duì)藥物的敏感性不同。高分化細(xì)胞Caco-2，IR值有明顯藥物濃度效應(yīng)，但時(shí)間效應(yīng)沒有另兩珠細(xì)胞表現(xiàn)明顯；未分化細(xì)胞Lovo與時(shí)間和藥物濃度效應(yīng)方面均有明顯相關(guān)性，但72 h與48 h的IR相比，并未出現(xiàn)更明顯的抑制效果；中分化細(xì)胞HT-29的IR值曲線意義介于兩者之間。另外研究顯示，Lovo細(xì)胞對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的敏感性最強(qiáng)，Caco-2細(xì)胞敏感性最弱，HT-29細(xì)胞的敏感性略強(qiáng)于Caco-2細(xì)胞，并顯示3種不同分化細(xì)胞株的敏感性并未在48h后隨時(shí)間呈更強(qiáng)敏感性(P>0.05)。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)不同分化結(jié)腸癌細(xì)胞株有不同的敏感性和增殖抑制作用，值得注意的是，對(duì)未分化細(xì)胞成高敏感性，而對(duì)分化程度較高細(xì)胞敏感性偏低，這說明穿心蓮內(nèi)酯對(duì)分化程度低的結(jié)腸癌有明顯的優(yōu)勢(shì)，對(duì)治療分化較差的結(jié)腸癌有良好的前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 呂巧莉，涂國剛，王嘉琦，等.穿心蓮內(nèi)酯的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版， 2013，53(1)：83-86.

[2]戴桂馥，趙進(jìn)，王慶端，等．穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)人食管癌Ec9706細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J]．中國藥理學(xué)通報(bào)， 2009，25(2)：173-176.

[3]Jada S R. Semisynthesis and cytotoxic activities of andrographolide analogues[J].J Enzyme Inhib Med Chem, 2006,21(2):144-155.

[4]Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics， 2009[J]. CA Cancer J Clin，2009,59(4):225-249.

[5]方興國，楊 芳，周元昆，等. 青年人大腸癌105例腸鏡表現(xiàn)及其病理特征分析[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010，33(5)：455-457.