王鵬良+韋翠娥+覃柳輝+楊利平+張照遠(yuǎn)+吳幼媚+覃子海

摘 要：WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病蟲、耐逆境等眾多過程，并在其中起重要作用。為了研究WRKY在赤桉中的結(jié)構(gòu)和功能，本研究利用電子克隆的方法克隆了赤桉與AtWRKY50高度同源的一個(gè)WRKY基因EcWRKY50，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因編碼蛋白的氨基酸組成，理化性質(zhì)，亞細(xì)胞定位和高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，EcWRKY50基因全長(zhǎng)為585 bp，包含一個(gè)480 bp的開放閱讀框，編碼159個(gè)氨基酸，該基因蛋白分子量為18.187 KD，理論等電點(diǎn)為5.45。該蛋白含有一個(gè)WRKYGKK的保守結(jié)構(gòu)域和C2H2結(jié)構(gòu)域，屬于GroupⅡc成員，很可能在細(xì)胞質(zhì)中起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用；并對(duì)該蛋白進(jìn)行了同源性分析。這些研究為該基因功能的進(jìn)一步分析奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：赤桉 EcWRKY50轉(zhuǎn)錄因子 基因電子克隆 生物信息學(xué)分析

桉樹是桃金娘科（Myrtaceae）桉樹屬（Eucalyptus）的總稱，原產(chǎn)于澳大利亞及其附近島嶼。桉樹生長(zhǎng)迅速，輪伐周期短，用途廣泛，經(jīng)濟(jì)效益顯著，已經(jīng)成為我國主要的短周期工業(yè)用材樹種。

赤桉（Eucalyptus camaldulensis）是在澳大利亞分布最廣，引種較多的樹種[1 ]。赤桉其木材可制作高檔家具，工藝品，還可以作為鋸材、紙槳材、干材和薪炭林等重要用途，同時(shí)其對(duì)干旱[1 ]，低溫[2-5 ]，高溫[6 ]和鹽堿等逆境有較好的適應(yīng)能力，而且耐瘠薄。由于其良好耐逆性，赤桉已經(jīng)在全世界廣泛種植，而且種植面積呈日趨擴(kuò)大之勢(shì)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，WRKY轉(zhuǎn)錄因子由其N端的保守氨基酸WRKY而得名，由于其在不同的進(jìn)化模式，從而產(chǎn)生了多樣的WRKY基因成員[7 ]。研究人員已經(jīng)在水稻，短柄草等多種植物中鑒定出近百個(gè)WRKY基因成員[8-10 ]，其成員廣泛參與植物的抗逆，抗病，生長(zhǎng)發(fā)育和衰老等多個(gè)生理代謝通路，并起重要作用[11]。WRKY50基因是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的一個(gè)成員，但尚未見赤桉WRKY50基因克隆及分析的相關(guān)報(bào)道。

電子克?。↖n silico cloning）是在基因組或EST測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行基因克隆的新方法[12 ]。本研究利用該技術(shù)開展赤桉WRKY50轉(zhuǎn)錄因子的克隆及序列分析，并對(duì)基因編碼蛋白的氨基酸組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等多方面進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為該基因的實(shí)驗(yàn)克隆，功能分析及其應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 EST序列來源

2013年12月5日從dbEST/GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/ nucest）中以FASTA格式下載58584條EST序列。

1.2 基因全長(zhǎng)的獲得

①利用Trimmer截去EST序列兩端的載體序列，再利用編寫的Perl腳本提取可能含有WRKY氨基酸的EST序列。

②利用NCBI中Blastx（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)可能含有WRKY氨基酸的EST進(jìn)行比對(duì)，其中數(shù)據(jù)庫為Nr（Non-redundant protein sequences）。

③利用NCBI中ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）對(duì)含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域的EST搜索開放閱讀框（ORF， Open Reading Frame），得到WRKY轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)基因。

1.3 EcWRKY50基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

① EcWRKY50蛋白氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 利用ExPASy服務(wù)器（http：// www. expasy. org/ resources）中的ProtParam、Compute pI/Mw和ProtScale軟件預(yù)測(cè)EcWRKY50蛋白的氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)、疏水性/親水性、不穩(wěn)定系數(shù)及脂肪系數(shù)等。

②EcWRKY50蛋白的亞細(xì)胞定位 利用在線軟件PSORT（http：//psort.hgc.jp/form. html），預(yù)測(cè)EcWRKY50蛋白的位置。

③EcWRKY50蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

④EcWRKY50蛋白結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用ExPASy 中SWISS-MODEL workspace（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

⑤EcWRKY50基因的功能分類 利用ProtFun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ ProtFun/）預(yù)測(cè)該基因的功能分類。

⑥EcWRKY50基因的同源性分析 利用NCBI中Blast程序?qū)cWRKY50蛋白進(jìn)行比對(duì)，并選擇與該蛋白同源性高的不同物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 EcWRKY50基因的克隆

首先對(duì)下載的赤桉58584條EST序列兩端各截去25 bp，以去除載體序列，再以WRKY蛋白對(duì)應(yīng)的DNA為探針，利用自己編寫的perl腳本搜索到110條可能含有WRKY蛋白的EST序列。利用NCBI中Blastx程序?qū)?10條可能含有WRKY蛋白的EST序列進(jìn)行注釋，獲得17條含有WRKY的EST序列，再利用NCBI中ORF Finder對(duì)獲得的17條EST序列進(jìn)行開放閱讀框的搜尋，只獲得1條擁有完整的開放閱讀框的EST序列。該EST序列的長(zhǎng)度為585 bp，開放閱讀框（63～542 bp）的長(zhǎng)度為480 bp，以ATG為起始密碼子，以TAG為終止密碼子，編碼159個(gè)氨基酸。其推導(dǎo)的氨基酸序列N端具有1個(gè)WRKYGKK的保守結(jié)構(gòu)域，C端具有Cx4-5Cx22-23HxH結(jié)構(gòu)域（圖1），因此認(rèn)為該基因?yàn)閃RKY家族基因成員。由于該基因與AtWRKY50高度同源，屬于WRKY家族基因GroupⅡc成員，故命名為EcWRKY50。

2.2 EcWRKY50蛋白氨基酸序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPASy服務(wù)器中的ProtParam和Compute pI/Wm程序，預(yù)測(cè)EcWRKY50蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)、平均疏水性、不穩(wěn)定系數(shù)及脂肪系數(shù)等。由表1可見，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為53.31，大于40，說明該蛋白不太穩(wěn)定；平均疏水性為-1.136，說明該蛋白可能是親水性蛋白。

由表2可知，該蛋白由20種氨基酸組成，其中Ser（S）含量最高，為10.1%，其次為Glu（E），占9.4%；Cys（C）和Trp（W）含量最低，均為1.3%。

疏/親水性是蛋白質(zhì)的重要屬性，其對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析具有重要參考價(jià)值。因此利用ProtScale對(duì)EcWRKY50蛋白進(jìn)行疏/親水性分析，結(jié)果見表2。采用Kyte & Doolittle標(biāo)度計(jì)算，得到明顯的親水信號(hào)，如圖2。圖2顯示，除了5個(gè)小峰表現(xiàn)疏水性外，整體表現(xiàn)為親水性，這再次表明該蛋白為親水性的不穩(wěn)定蛋白。

2.3 EcWRKY50蛋白的亞細(xì)胞定位

基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布與該蛋白的功能緊密相關(guān)，從而在一定程度上反映了該基因的功能。研究采用PSPORT程序預(yù)測(cè)EcWRKY50的可能分布位置，從表3來看，該蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中的可能性最大。

2.4 EcWRKY50蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架通過α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等方式盤繞折疊而成。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，由表4，圖3表明，該蛋白由α螺旋、β折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中α螺旋和無規(guī)則卷曲的比例較高，分別為25.16%和53.46%，延伸鏈和β折疊的比例相對(duì)較低，分別為14.47%和6.92%。

2.5 EcWRKY50蛋白結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

正常情況下蛋白質(zhì)并不是以完全伸展的多肽鏈而是以緊密折疊的結(jié)構(gòu)存在， 并且一個(gè)特定蛋白質(zhì)行使其功能的能力通常是由它的三維結(jié)構(gòu)或構(gòu)象決定。因此，研究利用ExPASy 中SWISS-MODEL workspace程序預(yù)測(cè)了其蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。

2.6 EcWRKY50的功能分類

基因功能分類是基因注釋過程中的重要環(huán)節(jié)之一。為了加強(qiáng)對(duì)EcWRKY50基因的認(rèn)識(shí)，增加對(duì)該基因功能了解，研究對(duì)該基因進(jìn)行了功能分類，功能分類結(jié)果（見表5）表明，EcWRKY50最重要的功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄，其概率分別為0.345和0.269，這符合轉(zhuǎn)錄因子的功能。

2.7 EcWRKY50基因的同源性分析

以EcWRKY50為探針，利用NCBI中Blast程序與reference protein數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，搜索到與該探針蛋白同源性較高的蛋白，這些蛋白基本上都是來自不同物種的WRKY50蛋白。研究選與該蛋白同源性高的橙子（Citrus sinensis），可可（Theobroma cacao），蓖麻（Ricinus communis），葡萄（Vitis vinifera），黃豆（Glycine max），鷹嘴豆（Cicer arietinum），蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），擬南芥（Arabidopsis thaliana），琴葉擬南芥（Arabidopsis lyrata）9個(gè)物種的WRKY蛋白進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)（見圖5），發(fā)現(xiàn)在保守結(jié)構(gòu)域上氨基酸相似度高，在非保守結(jié)構(gòu)域上氨基酸的變化較大。

研究利用上述9個(gè)物種的WRKY蛋白和EcWRKY50構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從圖6中顯示，親緣關(guān)系較近的擬南芥和琴葉擬南芥聚為一類，在一定程度上反映了物種間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

3 討論

隨著EST計(jì)劃，基因組計(jì)劃的深入開展，伴隨著測(cè)序技術(shù)的快速改進(jìn)，產(chǎn)生的EST序列和基因組數(shù)據(jù)越來越多，基因組研究已經(jīng)開始從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)的時(shí)代，獲得基因全長(zhǎng)是研究基因功能不可或缺的環(huán)節(jié)。在這樣的情況下，電子克隆應(yīng)用而生，其特點(diǎn)非常明顯，高效快速，成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)要求也低[13 ]，勢(shì)必大大推動(dòng)功能基因組的研究。

在電子克隆過程中，探針的選擇對(duì)能否成功地獲得基因全長(zhǎng)起到重要作用，當(dāng)選擇的探針較長(zhǎng)時(shí)，能較完整匹配的序列就少，減少了獲得全長(zhǎng)的可能性；當(dāng)選擇探針較短時(shí)，能更多地匹配相應(yīng)序列，經(jīng)過對(duì)匹配序列的拼接，可獲得較多的序列，增加了獲得全長(zhǎng)的可能性；同時(shí)也增加了工作量。考慮到使用序列的來源不同（不同的樹種、單株或處理），通過電子克隆獲得的基因全長(zhǎng)與真實(shí)狀況下的基因可能存在差異[14 ]，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

WRKY基因家族擁有眾多成員，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，抗病蟲，耐逆境及衰老等許多方面起重要作用。據(jù)報(bào)道，AtWRKY50蛋白參與水楊酸和低油酸抑制茉莉酸信號(hào)的通路從而調(diào)控植物對(duì)病蟲害的抗性[15 ]。實(shí)驗(yàn)利用電子克隆技術(shù)克隆EcWRKY50蛋白基因，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步利用實(shí)驗(yàn)手段研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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