胡靜， 侯新遠(yuǎn)，尹紹武， 祝斐， 賈一何， 胡亞麗

（1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228）

波紋唇魚（Cheilinus undulatus），在分類學(xué)上隸屬鱸形目（Perciformes）、隆頭魚科（Labridae）、唇魚屬（Cheilinus），是一種暖水性魚類，同時(shí)也是體型最大的珊瑚礁魚類之一。分布于非洲東岸、紅海以及印度洋至太平洋中心，在我國(guó)主要分布于南海與東海的南部海域（沈世杰，1993；Donaldson etal，2001）。波紋唇魚為名貴的海水經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩味鮮，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受亞洲人喜愛。因過(guò)度捕撈及珊瑚礁棲息地破壞等因素，導(dǎo)致自然海區(qū)的波紋唇魚數(shù)量越來(lái)越少，目前已瀕臨滅絕。1996-2005年間波紋唇魚曾四度被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）、世界自然基金會(huì)（WWF）等組織和《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）列入瀕危物種名單。因此，有關(guān)波紋唇魚的遺傳資源調(diào)查、資源保護(hù)等工作亟待加強(qiáng)。

有關(guān)波紋唇魚繁殖研究，印度尼西亞和我國(guó)均對(duì)波紋唇魚進(jìn)行過(guò)人工誘導(dǎo)產(chǎn)卵試驗(yàn)，仔魚培育均未獲成功，該魚規(guī)?；庇y題仍然沒(méi)有突破，仍舊采用的是野種家養(yǎng)的方式 （Murdjani et al，1996；頡曉勇等，2001）。

國(guó)內(nèi)有關(guān)波紋唇魚的研究在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及食用中毒及毒后救護(hù)方面有少許報(bào)道，對(duì)其同工酶、染色體核型分析以及線粒體全序列也進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道（霍蕊，2009；區(qū)又君等，2009）。

國(guó)外對(duì)波紋唇魚的基礎(chǔ)生物學(xué)等方面報(bào)道較多（Donaldson et al，2001；Sadovy et al，2003）。但是，目前少見關(guān)于波紋唇魚分子遺傳學(xué)方面的報(bào)道（胡靜等，2012；彭艷輝等，2012），尤其是有關(guān)其種質(zhì)資源和遺傳多樣性的研究。近年來(lái)，隨著mtDNA研究的不斷深入，因?yàn)槠渚哂蟹肿恿啃?、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、演化速度快、母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)而成為有效的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于物種系統(tǒng)進(jìn)化研究（郭新紅 等，2004； 朱葉 等，2012； 沈玉幫 等，2011；徐敬明，2010）。由于mtDNA ND1基因序列的保守性，一般很少用來(lái)作為同種生物多樣性的研究，而多用在種間遺傳分析水平上（Carr etal，1991；Chapman，1994），但也有少數(shù)關(guān)于ND1基因結(jié)合其他基因來(lái)研究種內(nèi)和群體系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究報(bào)道（邵愛華等，2007；周春花等，2007）。

本研究對(duì)分布于海南陵水、馬來(lái)西亞、西沙以及南沙4個(gè)不同地理群體波紋唇魚共101尾個(gè)體的ND1基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，旨在研究波紋唇魚群體的ND1基因序列變異情況，分析其序列多態(tài)性、遺傳多樣性以及群體的遺傳關(guān)系，以獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，為該物種種群遺傳多樣性和保護(hù)生物學(xué)的研究提供科學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

野生群體波紋唇魚共101尾，分別為海南陵水（LC）、馬來(lái)西亞 （MC）、西沙 （XC）以及南沙（NC）4個(gè)不同地理群體（圖1），各31、20、14、36尾，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定（沈世杰，1993），對(duì)101尾個(gè)體編號(hào)，取樣品尾鰭組織于95%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 波紋唇魚的取材位置

1.2 DNA的提取、擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

分別取0.1 g尾鰭組織來(lái)提取基因組DNA。基因組DNA的提取按常規(guī)的“酚–氯仿”方法進(jìn)行（薩姆布魯克，1995），DNA經(jīng)冰乙醇沉淀、70%乙醇洗滌并干燥后，用50μLTE溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從Genbank中導(dǎo)出波紋唇魚的mtDNA全序列（序列號(hào)：GU296101），使用Primer primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增ND1基因的1對(duì)引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。正向引物為F1（5'CGTTAATGTGGCAGAGCT 3'），反向引物為R1（5'CTAAAAGGAGATGGAGGG 3'）。

每個(gè)PCR反應(yīng)總體積均為25μL，其中包括2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL Mg2+（25 mmol/L），2μL dNTP（2 mmol/L），正反向引物各 1μL（10 μmol/L），0.3μLTaq DNA polymerase（5U/μL），14.2μL ddH2O，模板 2μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，然后進(jìn)行30個(gè)熱循環(huán)（94℃、30 s，51℃、30 s，72℃、2 min），72℃延伸10min；10℃保溫。

擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的條帶切下并用DNA純化試劑盒回收，目的片段與pMDTM18-TVector*1（寶生物工程有限公司）連接。連接產(chǎn)物與DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞充分混勻轉(zhuǎn)化。挑取目的單克隆菌落于含有氨芐的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，克隆后對(duì)其菌液進(jìn)行雙向測(cè)序，由上海華大基因公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

雙向測(cè)序結(jié)果在BLAST上進(jìn)行比對(duì)分析后，人工拼接成完整序列；在ClustalX軟件上對(duì)比、參照波紋唇魚mtDNA全序列（序列號(hào)：GU296101）中對(duì)應(yīng)的基因剪切測(cè)序所得序列，對(duì)比后的序列在MEGA 5.0軟件 （Tamura，2011）上依據(jù) Kimura 2-parameter模型計(jì)算群體內(nèi)及群體間的平均遺傳距離，并構(gòu)建線粒體ND1基因的單倍型NJ系統(tǒng)樹，各分支的置信度由1 000次自舉法檢驗(yàn)；由Dnasp 5.0軟件 （Librado etal，2009）計(jì)算得出遺傳多樣性參數(shù)，如核苷酸多樣性Pi以及單倍型多樣性Hd等；4個(gè)群體單倍型數(shù)目、類型及分布由軟件Areliquin 3.5（Excoffier，2005）生成，最后由該軟件計(jì)算出堿基含量以及pairwise difference模型下的遺傳分化參數(shù)并進(jìn)行AMOVA分析和Tajima′s D 中性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 目的片段的序列特征及群體內(nèi)的序列變異

對(duì)4個(gè)不同地理群體的波紋唇魚共101尾個(gè)體的ND1基因序列進(jìn)行測(cè)定，得到長(zhǎng)度為975 bp的堿基序列。利用BLAST軟件將ND1基因的101條序列與NCBI上波紋唇魚線粒體全序列（序列號(hào)：GU296101）相應(yīng)的序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明兩者之間同源性很高，有的完全一致。

4個(gè)堿基A、T、G、C在101尾個(gè)體中的平均含量分別為23.79%、27.08%、15.49%和33.64%，其中各堿基含量變化范圍在0.01%之間。即A+T（50.87%）＞G+C（49.13%），其中海南陵水群體（LC）的堿基含量為A 23.79%、T 27.08%、G 15.49%、C33.64% （A+T（50.87%）＞G+C（49.13%））；馬來(lái)西亞群體（MC）的堿基含量為A 23.80%、T 27.08%、G 15.48%、C 33.64%（A+T（50.88%）＞G+C（49.12%））；西沙群體（XC）的堿基含量為A 23.79%、T 27.09%、G 15.48%、C 33.64% （A+T（50.88%）＞G+C（49.12%））；南沙群體（NC）的堿基含量為A 23.80%、T 27.07%、G 15.49%、C 33.64%（A+T（50.87%）＞G+C（49.13%））。A+T含量大于C+G含量，表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性（見表1）。

表1 波紋唇魚4個(gè)群體ND1基因序列的堿基含量

2.2 遺傳多樣性分析

由表2可知，海南陵水、馬來(lái)西亞、西沙、南沙4個(gè)地理群體波紋唇魚的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)分別為7、2、2、5，單倍型數(shù)目及其多樣性指數(shù)（Hd）分別為9/0.456、3/0.195、2/0.143、6/0.262，而核苷酸多樣性（Pi）以及平均核苷酸差異數(shù)（K）分別為 0.000 53/0.514、0.000 21/0.200、0.000 29/0.286，0.000 29/0.278，基于單倍型多樣性的比較依次為海南陵水＞南沙＞馬來(lái)西亞＞西沙，而核苷酸多樣性比較依次為海南陵水＞西沙=南沙＞馬來(lái)西亞，平均核苷酸差異數(shù)依次為海南陵水＞西沙＞南沙＞馬來(lái)西亞。數(shù)據(jù)分析表明，遺傳多樣性參數(shù)Hd、Pi和K之間不存在正向相關(guān)的關(guān)系，沒(méi)有必然的聯(lián)系。

表2 波紋唇魚4個(gè)群體ND1基因的遺傳多樣性參數(shù)及Tajima′s D 中性檢測(cè)

Tajima′D中性檢驗(yàn)法被用來(lái)對(duì)不同群體波紋唇魚受到選擇作用的影響進(jìn)行檢測(cè)（表2）。從中性檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，4個(gè)波紋唇魚群體（-2.071 71、-1.512 84、-1.480 74和-2.007 09）及所有個(gè)體（-1.768 09）水平上的Tajima′s D均為負(fù)值，說(shuō)明波紋唇魚經(jīng)歷過(guò)近期群體擴(kuò)張或瓶頸效應(yīng)。

2.3 遺傳分化分析

由表3看出，群體內(nèi)遺傳距離的大小依次為海南陵水 （0.000 53）＞西沙 （0.000 30）＞南沙 （0.000 29）＞馬來(lái)西亞（0.000 21），群體間的遺傳距離范圍為0.000 25（馬來(lái)西亞和西沙、馬來(lái)西亞和南沙）～0.000 41（海南陵水和西沙、海南陵水和南沙）。波紋唇魚的遺傳分化分析中，F(xiàn)st很低，甚至出現(xiàn)了負(fù)數(shù)，表明群體間遺傳分化不明顯；而海南陵水和馬來(lái)西亞群體波紋唇魚的遺傳分化為0.354 26，且P﹤0.01，說(shuō)明這兩個(gè)群體間存在遺傳分化且極顯著。

表3 波紋唇魚4個(gè)群體ND1基因群體間/群體內(nèi)的K im ura 2-param eter遺傳距離（左下角）及遺傳分化（右上角）

AMOVA分析（表4）數(shù)據(jù)表明，-0.58%的變異來(lái)自群體間而100.58%的來(lái)自群體內(nèi)。

表4 波紋唇魚4個(gè)群體ND1基因的AMOVA分析

2.4 單倍型分析

圖2 波紋唇魚4個(gè)群體ND1基因構(gòu)建的單倍型NJ系統(tǒng)樹

表5 波紋唇魚4個(gè)群體的ND1基因的單倍型數(shù)目類型、頻率及分布

由軟件MEGA5.0生成的海南陵水、馬來(lái)西亞、西沙、南沙4個(gè)群體ND1基因的單倍型NJ系統(tǒng)樹見圖2，不同地理來(lái)源的單倍型均勻交錯(cuò)分布，無(wú)明顯分支，沒(méi)有體現(xiàn)地理差異性。由軟件Areliquin 3.5生成的海南陵水、馬來(lái)西亞、西沙、南沙共101尾個(gè)體的ND1基因單倍型數(shù)目、類型、頻率及分布情況見表5，其中共享單倍型個(gè)數(shù)有4個(gè)，分別為Hap3、Hap5、Hap6和Hap7，比例為28.57%（4/14）。在共享單倍型中分布最廣泛的是Hap3，海南陵水23尾個(gè)體、馬來(lái)西亞18尾個(gè)體、西沙13尾個(gè)體以及南沙31尾個(gè)體均共用此單倍型，其比例高達(dá)84.16%（85/101），該單倍型在每個(gè)群體中出現(xiàn)的比例分別高達(dá)74.19%、90.00%、92.86%、86.10%。在共享單倍型中，除了Hap3，其他均為2個(gè)種群共享，另外10個(gè)單倍型均為獨(dú)享單倍型。

3 討論

3.1 目的片段序列特征

波紋唇魚線粒體DNA ND1基因分析得出的序列堿基含量為A+T﹥G+C。線粒體DNA中A+T的含量越高，說(shuō)明該物種進(jìn)化地位也高，同時(shí)A+T含量的增加也增加了密碼子第三位點(diǎn)上A與T顛換的可能性（Folmer etal，1994）。而4種核苷酸在mtDNA中呈不均一分布狀態(tài)，也是動(dòng)物線粒體基因組共性的特征（Brown，1985）。

3.2 遺傳多樣性及種群的動(dòng)態(tài)

遺傳多樣性是存在于生物個(gè)體內(nèi)、單個(gè)物種內(nèi)以及物種間的基因多樣性，是進(jìn)化和適應(yīng)性的基礎(chǔ)，種內(nèi)的遺傳多樣性越豐富，該物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越大。衡量遺傳多樣性的指數(shù)有兩個(gè)重要指標(biāo)：?jiǎn)伪缎烷g的平均遺傳距離（K）和核苷酸多樣性（Pi），而Pi值考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，故更能精確的揭示一個(gè)群體的mtDNA的多態(tài)程度（周蕙，2006），同時(shí)是衡量群體多態(tài)程度和群體遺傳分化的重要指標(biāo)之一，Pi值越大表示群體多態(tài)程度越高，反之亦然。當(dāng)Pi值在 0.001 5～0.004 7 范圍內(nèi)時(shí) （Lan etal，1993），則表明遺傳多樣性處于較低水平，本研究由ND1基因序列得出的波紋唇魚整體水平的Pi值為0.000 35，說(shuō)明波紋唇魚遺傳多樣性低，這可能與波紋唇魚的棲息地及人為因素有關(guān)，波紋唇魚作為珊瑚礁棲息類魚，其棲息地珊瑚礁正面臨大面積的污染，高殺傷力漁具的捕撈也對(duì)其產(chǎn)生了不可恢復(fù)的損傷，甚至瀕臨消失。目前波紋唇魚的野生資源有限，分布也越來(lái)越窄，這有利于個(gè)體間或群體產(chǎn)生基因交流，而基因交流會(huì)進(jìn)一步地減少個(gè)體間的差異，使得遺傳多樣性降低。并且從中性檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，每個(gè)群體及所有個(gè)體水平上的Tajima′sD均為負(fù)值，此結(jié)果說(shuō)明這4個(gè)海域地區(qū)的波紋唇魚經(jīng)歷過(guò)近期群體擴(kuò)張或瓶頸效應(yīng)，由一個(gè)較小的有效種群逐漸發(fā)展而來(lái)，但還未能積累核苷酸序列的多樣化 （Avise，2000）。

3.3 群體的遺傳結(jié)構(gòu)

Fst常用來(lái)表示群體之間的分化程度。對(duì)于遺傳分化指數(shù)大小和分化程度的解釋，Wright提出Fst值在0.05～0.15之間表明遺傳分化達(dá)中等水平（Wright，1951）。本研究中不同群體（除海南陵水和馬來(lái)西亞群體）之間Fst很低，甚至出現(xiàn)了負(fù)數(shù)，說(shuō)明群體間遺傳差異很小。這可能是由于各群體還沒(méi)有經(jīng)過(guò)足夠長(zhǎng)的時(shí)間和完全的地理隔離來(lái)累積足夠多的特有的突變，而海南陵水和馬來(lái)西亞群體波紋唇魚的遺傳分化大且極顯著，這可能與海南陵水這一群體地理隔離明顯有關(guān)，其遺傳多樣性參數(shù)Hd、K、Pi均高于其他群體，且群體內(nèi)遺傳距離高于所有群體間遺傳距離可以共同驗(yàn)證這一推測(cè)。從分子方差分析（AMOVA）來(lái)看，基本上全部的變異都是存在群體內(nèi)，與Fst的結(jié)果一致。同時(shí)也暗示某一群體的變異水平超過(guò)了整體水平，此群體經(jīng)歷了高度進(jìn)化，從而提供了大量變異，使得群體間的變異貢獻(xiàn)不明顯，進(jìn)一步印證了上面得出的的結(jié)論：海南陵水群體存在高度進(jìn)化。

從單倍型分布及頻率中可看出這4個(gè)野生波紋唇魚群體的單倍型以Hap3為主。溯祖理論（Crandalletal，1993）認(rèn)為分布最廣泛的單倍型為祖先類型，因此推測(cè)這4個(gè)群體波紋唇魚單倍型共同起源于單倍型Hap3。NJ系統(tǒng)樹表明4個(gè)波紋唇魚群體也沒(méi)有完全分開，而是不同群體的單倍型錯(cuò)亂交織在一起。這也提示了群體間進(jìn)行了廣泛的基因交流，遺傳分化水平低。

本研究基于線粒體ND1基因序列變異對(duì)海南陵水、馬來(lái)西亞、西沙和南沙4個(gè)不同地理群體的波紋唇魚進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳分化研究，結(jié)果均顯示波紋唇魚的遺傳多樣性處于較低水平，遺傳分化水平低。由于取材的限制，雖然不能完全反映各大海域波紋唇魚群體遺傳多樣性水平和群體分化程度，也不能完全確定遺傳多樣性是否受到人為因素的影響，但為后續(xù)的波紋唇魚研究積累了遺傳多樣性參考資料，為波紋唇魚的種質(zhì)資源保護(hù)工作提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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