葉小金，宮 莉，王紅蕾，王曉俊，徐洪章，薛冬樺

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130012）

丁二酸又稱琥珀酸，是一種重要的有機(jī)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、食品等領(lǐng)域［1－2］。工業(yè)級(jí)丁二酸主要通過(guò)化學(xué)法合成，不僅污染嚴(yán)重，而且所用原料是不可再生的石油化工產(chǎn)品［3－4］。因此，在石油資源日益枯竭的今天，環(huán)境友好的生物發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸越來(lái)越引起重視［5－6］。

提取生物基丁二酸大多采用鈣鹽法，即在發(fā)酵液中加入鈣離子形成丁二酸鈣鹽沉淀，以達(dá)到分離丁二酸的目的，但其收率和純度并不理想［7］。絡(luò)合萃取法是通過(guò)萃取分離發(fā)酵液中丁二酸，然后反萃，獲得目標(biāo)產(chǎn)物生物基丁二酸，該法污染環(huán)境，成本較高［8－9］。基于丁二酸在pH≤2、溫度為0～4℃時(shí)，溶解度降低，可通過(guò)酸結(jié)晶法析出丁二酸晶體，但收率和純度較低［10］。因此，高效分離純化發(fā)酵液中丁二酸成為研究熱點(diǎn)。

作者根據(jù)丁二酸鹽在有機(jī)溶劑中的溶解度，經(jīng)酸化與酯化分離純化丁二酸，擬為生物發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 原理

生物發(fā)酵法產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵液中，丁二酸以鹽的形式存在（微溶于醇溶劑），加酸使丁二酸鹽酸化為丁二酸與水合鹽（不溶于醇溶劑），加入醇溶劑后鹽析形成沉淀，同時(shí)丁二酸與醇溶劑發(fā)生酯化反應(yīng)，溶于醇溶劑中。此酯化反應(yīng)是可逆反應(yīng)，將醇溶劑蒸餾除去，余下的晶體即為生物基丁二酸。反應(yīng)式如下：

反應(yīng)式（1）、（2）均為可逆反應(yīng)，當(dāng)醇過(guò)量時(shí)，反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行；當(dāng)醇不足時(shí)，反應(yīng)向逆反應(yīng)方向進(jìn)行，由此達(dá)到分離純化生物基丁二酸的目的。

1．2 方法

1．2．1 丁二酸的制備

以玉米秸稈水解液為碳源，菌株Actinobacillus succinogenes X－1深層厭氧發(fā)酵獲得丁二酸發(fā)酵液，離心去除菌體，用活性炭吸附殘余色素等雜質(zhì)，經(jīng)蒸餾濃縮為固體。

1．2．2 測(cè)試與表征

3）紅外光譜分析

生物基丁二酸的紅外光譜分析采用Perkin－Elmer Spectrum One型傅立葉變換紅外光譜儀。測(cè)試前，樣品在50℃下干燥24h，KBr壓片。分辨率為4cm－1，掃描范圍為4 000～450cm－1。

4）X－射線衍射（XRD）分析

采用北京普析通用型X－射線衍射儀對(duì)生物基丁二酸進(jìn)行表征。Cuκα 射線，Ni片濾波，λ＝0．154 nm，掃描范圍：2θ＝15°～50°，步進(jìn)掃描：Δ2θ＝4°·min－1。

5）掃描電子顯微鏡（SEM）分析

采用JSM－5600型掃描電子顯微鏡對(duì)生物基丁二酸的微觀形貌進(jìn)行分析，測(cè)試電壓0～25kV，分辨率30mm。

2 結(jié)果與討論

1）濃度分析

應(yīng)用Waters 600系統(tǒng)HPLC，流動(dòng)相為5mmol·L－1硫酸，色譜柱為 Waters C18色譜柱（150mm×3．9mm）。利用 Waters 2487紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量為10μL，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2）丁二酸純度的測(cè)定

取一定質(zhì)量（m）生物基丁二酸晶體，加入一定體積（V）水完全溶解后，測(cè)定溶液中丁二酸的濃度（c），按下式計(jì)算丁二酸純度（W）：

2．1 丁二酸二鈉在乙醇中的溶解度

在丁二酸發(fā)酵過(guò)程中，要加緩沖劑以維持內(nèi)環(huán)境的pH值，達(dá)到丁二酸的持續(xù)積累［11］。但緩沖劑中含有的金屬離子以丁二酸鹽形式存在于發(fā)酵液中，影響丁二酸的分離純化。利用酸化后水合鹽不溶于醇溶劑的性質(zhì)，可將金屬離子與丁二酸分離，達(dá)到純化丁二酸的目的。

不同溫度下，丁二酸二鈉在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解度見(jiàn)圖1。

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%時(shí)，丁二酸二鈉的溶解度小于0．1g·（100g）－1，不同溫度下，丁二酸二鈉溶解度變化不大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于80%時(shí)，丁二酸二鈉的溶解度均顯著提高。文獻(xiàn)［11］報(bào)道，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，水合硫酸鈉在乙醇中的溶解度小于0．1g·（100g）－1。與以無(wú)水乙醇或水為溶劑相比，丁二酸更易溶于一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑中［12－13］。綜合考慮，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，丁二酸二鈉和水合硫酸鈉都微溶，丁二酸溶解度變大，有利于丁二酸的分離。

圖1 丁二酸二鈉在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解度Fig．1 Solubility of Na2Succ in ethanol with different volume fractions

2．2 生物基丁二酸酯化工藝條件的優(yōu)化

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察丁二酸鹽種類（A）、氫離子與丁二酸鹽的物質(zhì)的量比（B）及反應(yīng)時(shí)間（C）對(duì)丁二酸收率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab．1Results and analysis of orthogonal experiment

由表1可知，各因素對(duì)生物基丁二酸收率的影響大小依次為：丁二酸鹽種類＞氫離子與丁二酸鹽的物質(zhì)的量比＞反應(yīng)時(shí)間。最優(yōu)的酯化工藝條件為A1B2C2，即丁二酸鹽為丁二酸二鈉、氫離子與丁二酸二鈉的物質(zhì)的量比為2．2∶1、反應(yīng)時(shí)間為12h，在此條件下，生物基丁二酸的收率為91．7%。

2．3 生物基丁二酸純化工藝條件的優(yōu)化

玉米秸稈水解液發(fā)酵提取的生物基丁二酸含有雜質(zhì)及色素，需加活性炭進(jìn)行吸附純化生物基丁二酸。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，選定活性炭加量（A′）、脫色溫度（B′）和脫色時(shí)間（C′）3個(gè)因素為變量，各選取3個(gè)水平，目標(biāo)參數(shù)為生物基丁二酸純度。

2．3．1 生物基丁二酸純化回歸模型建立及方差分析

生物基丁二酸純化工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert 7．0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，二階響應(yīng)面模型結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。

表2 生物基丁二酸純化工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab．2 Design and results of response surface analysis of purification process of bio－based succinic acid

通常P值小于0．05為顯著［14］。由表3可知：各因素對(duì)生物基丁二酸純度影響的大小依次為：脫色時(shí)間＞脫色溫度＞活性炭加量。模型的P值小于0．0001，可見(jiàn)該模型為高度顯著；失擬項(xiàng)的F值為4．00，表明該方程的擬合效果較好；A′、B′、C′、A′2、B′2和 C′26項(xiàng)為高度顯著，A′B′為不顯著，其它項(xiàng)為顯著；失擬項(xiàng)P＝0．1067＞0．05，失擬檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，表明該模型與數(shù)據(jù)擬合較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用于生物基丁二酸純化結(jié)果的分析和預(yù)測(cè)。擬合二元多項(xiàng)回歸方程為：Y＝97．62＋2．85A′＋3．45B′＋3．78C′0．20A′B′－1．00A′C′－0．55B′C′－7．91A′2－6．71B′2－5．01C′2，其中Y為響應(yīng)值，即生物基丁二酸純度。

表3 回歸模型方差分析Tab．3 The analysis of regression model variance

2．3．2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

三維響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。

圖2 生物基丁二酸純化響應(yīng)面圖Fig．2 Response surface methodology of bio－based succinic acid purification

由圖2可知，活性炭加量、脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)生物基丁二酸純度的影響顯著，且活性炭加量與脫色時(shí)間交互作用明顯，該模型預(yù)測(cè)的最高純度為98．9%。優(yōu)化的純化條件為：活性炭加量3．3%、脫色溫度72℃、脫色時(shí)間37min。

2．3．3 優(yōu)化純化條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化純化條件即活性炭加量3．3%、脫色溫度72℃、脫色時(shí)間37min下，進(jìn)行5批次的生物基丁二酸純化實(shí)驗(yàn)，平均純度達(dá)到98．44%，接近回歸方程預(yù)測(cè)值。表明所建立模型可反映各因素對(duì)生物基丁二酸純度的影響，純化條件可行。

2．4 不同提取方法比較

表4歸納了不同提取方法得到的生物基丁二酸的收率和純度。

表4 不同提取方法得到的生物基丁二酸的收率與純度／%Tab．4 Yield and purity of bio－based succinic acid obtained by different extraction methods／%

由表4可知，與絡(luò)合萃取法、鈣鹽法、酸結(jié)晶法比較，酯化法提取生物基丁二酸的效果較好。

2．5 生物基丁二酸的表征

以色譜純丁二酸為標(biāo)樣，對(duì)生物基丁二酸進(jìn)行紅外表征，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 丁二酸標(biāo)樣（a）和生物基丁二酸（b）的紅外光譜Fig．3 IR Spectra of succinic acid standard sample（a），bio－based succinic acid（b）

由圖3可知：2 400～3 300cm－1處有寬吸收帶，1 419cm－1處有較強(qiáng)吸收，說(shuō)明存在－COOH；1 694 cm－1處為 C＝O伸縮振動(dòng)吸收，1 207cm－1和1 310 cm－1處分別為C－O伸縮振動(dòng)和O－H面內(nèi)變形振動(dòng)吸收，1 630～1 680cm－1處沒(méi)有吸收，說(shuō)明不存在C＝C鍵；生物基丁二酸與色譜純丁二酸的吸收峰吻合，具有相同的基團(tuán)，表明提取產(chǎn)物確為生物基丁二酸。

為進(jìn)一步表征生物基丁二酸的晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行X－射線衍射分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 丁二酸標(biāo)樣（a）和生物基丁二酸（b）的XRD圖譜Fig．4 XRD Patterns of succinic acid standard sample（a），bio－based succinic acid（b）

由圖4可知，與標(biāo)樣相比，生物基丁二酸在2θ為19．9°、26．0°和31．4°處具有相同的晶體特征峰。說(shuō)明酯化法提取的生物基丁二酸與標(biāo)樣有相同的晶型。

2．6 生物基丁二酸的微觀形貌

利用掃描電子顯微鏡觀察生物基丁二酸的微觀形貌，見(jiàn)圖5。

圖5 生物基丁二酸的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig．5 The SEM images of bio－based succinic acid

由圖5可知，與標(biāo)樣相比，酯化法得到的生物基丁二酸晶體在微觀形貌上不規(guī)則，晶體形狀各異，可能是酯化過(guò)程中其它物質(zhì)與丁二酸之間的相互作用力改變了生物基丁二酸晶體的外貌形狀［10］。與未純化生物基丁二酸相比，純化后的生物基丁二酸晶形更不規(guī)則，可能是因?yàn)榻Y(jié)晶溫度導(dǎo)致生物基丁二酸的微觀形貌發(fā)生了進(jìn)一步的改變［17］。

3 結(jié)論

（1）80%乙醇中，丁二酸二鈉和水合硫酸鈉微溶、丁二酸溶解度較大，有利于丁二酸的分離純化。

（2）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的酯化條件為：丁二酸鹽為丁二酸二鈉、氫離子與丁二酸二鈉的物質(zhì)的量比為2．2∶1、反應(yīng)時(shí)間為12h，在此條件下，生物基丁二酸收率為91．7%。Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的純化工藝為：活性炭加量3．3%、脫色溫度72℃、脫色時(shí)間37min，在此條件下，生物基丁二酸純度達(dá)到98．44%。

（3）通過(guò)紅外光譜和X－射線衍射分析確證所提取的物質(zhì)為生物基丁二酸，與丁二酸標(biāo)樣具有相同的晶體特征峰。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察可知，提取條件對(duì)丁二酸的微觀形貌有影響。

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