金錦蓮，吳發(fā)明，周海燕，謝曉晶，王新宇

（三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院／葛洲壩中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北宜昌 443002）

胃癌是世界上的第四大常見腫瘤，在腫瘤死亡原因中排名第二位。目前，研究表明晚期胃癌患者中只有約20%的患者生存期超過5年［1］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種內(nèi)源性和外源性因素累積的結(jié)果。胃癌的發(fā)生的內(nèi)源性因素通常與飲食習(xí)慣和胃部幽門螺桿菌感染率增加有關(guān)［2］，外源性因素則包括遺傳、飲食、胃泌素激素水平以及其他慢性胃部炎癥因子等［3］。

microRNA（miRNA）是一種非編碼的小片段RNA，參與mRNA的降解和翻譯調(diào)控。miRNA通過靶向結(jié)合于mRNAs的3′非翻譯區(qū)互補序列從而誘導(dǎo)mRNA降解或抑制翻譯，起到對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)作用［4］。近年來，miRNAs被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因，其通過對基因表達的調(diào)節(jié)而對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用［5］。在人類和鼠中，miRNA－219（miR－219）前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要是由 miR－219－1和 miR－219－2基因編碼。前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過剪切后成為成熟的miRNAs：包括從前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端轉(zhuǎn)錄的 miR－219－5p；分別從 miR－219－1前體轉(zhuǎn)錄成熟的 miR－219－1－3p和 miR－219－2前體轉(zhuǎn)錄成熟的 miR－219－2－3p。已有研究表明在惡性星形細(xì)胞瘤［6］和肝癌中 miR－219－5p表達量下降［7］，最新的研究報道，miR－219－2－3p在胃癌細(xì)胞系 MGC－803中表達量有所降低，且過表達 miR－219－2－3p可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，提示 miR－219－2－3p可能作為胃癌的候選抑癌基因［8］。

基于以上研究背景，本研究擬對本院2011～2012年進行手術(shù)治療的胃癌患者組織中miR－219－2－3p表達量的變化及其可能作用機制進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011～2012年在本院接受胃癌切除手術(shù)的82例胃癌患者，所納入的患者均簽訂了知情同意書。在病理醫(yī)師的指導(dǎo)下，切除適量的胃癌組織以及鄰近的癌旁組織（距離癌組織3cm）。手術(shù)切除后的新鮮標(biāo)本立即置于液氮中冷凍保存。所有患者年齡45～70歲。所有胃癌標(biāo)本均經(jīng)過病理診斷確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 實時聚合酶鏈反應(yīng)（real－time RT－PCR） 組織中總RNA抽提采用Trizol（Takara）試劑盒方法。采用Taqman miRNA的方法并通過real－time RT－PCR技術(shù)定量檢測82例胃癌病例中癌組織和鄰近正常組織的 miR－219－2－3p表達水平。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×RT buffer，0.1MDTT，200U／mL逆轉(zhuǎn)錄酶，40U／mL RNase抑制劑。反應(yīng)條件為37℃條件下55min，70℃條件下15min，－20℃保存。在ABI公司生產(chǎn)的7500real－time PCR儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL，包括1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1×Universal TaqMan Master Mix和1×Taqman probe／primer Mix（Invitrogen）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗 本研究采用的細(xì)胞株為人胃癌細(xì)胞株MGC803（胃黏液癌，低分化），購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心（北京）。培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），10% 胎牛血清（Gibco公司）和鏈霉素（100 mg／mL），青霉素（100U／mL）。在5%CO2，濕度大于95%的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24h分別于6孔板接種2×105／孔。24h后（約80%細(xì)胞貼壁后）進行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine TM2000說明書及參考文獻進行操作［9］。轉(zhuǎn)染6～8h后換液，培養(yǎng)48h后裂解細(xì)胞，并進行相關(guān)指標(biāo)分析。

1.2.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）分析 將 MGC803的全細(xì)胞成分及標(biāo)本組織勻漿用細(xì)胞裂解緩沖液裂解。裂解緩沖液的成份為20mM Tris－HCI、1mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、1mM釩酸鈉、0.2mM。收集蛋白并進行蛋白濃度測定（BCA法）。制備好的蛋白樣品放置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。電泳：每泳道上?0μg蛋白。用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜后封閉非特異性結(jié)合蛋白。然后加入一抗4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h。ECL顯色拍片。一抗包括 ERK1／2、p－ERK、β－actin。

1.2.4 細(xì)胞增殖測定 各組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 miR－219－2－3p，miRNA陰性對照，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含10%CCK－8的（Dojindo；日本）培養(yǎng)基在37℃孵育，可以視覺上看到顏色變化。分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72、96h在450nM 和630nM 波長處測定吸光度，計算細(xì)胞增殖速率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。miRNA的real－time PCR結(jié)果采用2－△△Ct方法對目的基因在癌組織及癌旁組織中的表達量進行相對定量分析。計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織中miR－219－2－3p的表達變化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析 與癌旁組織比較，59.7%（49／82）腫瘤組織中miR－219－2－3p表達量降低。作者進一步對 miR－219－2－3p表達與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性進行分析，結(jié)果如表1，miR－219－2－3p在胃癌組織中的表達與臨床分期相關(guān)性表現(xiàn)為，miR－219－2－3p表達量越低，患者臨床分期級別越高（P＜0.05），而與年齡、性別、癌變部位、Lauren′s分類、淋巴結(jié)侵襲無關(guān)（P＞0.05）。

圖1 miR－219－2－3p過表達對 MGC803細(xì)胞增殖影響

2.2 miR－129－2－3p對胃癌細(xì)胞增殖的影響 由圖1細(xì)胞增殖實驗結(jié)果可知，與空白對照組（未經(jīng)任何處理）及陰性對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）相比，在 MGC803細(xì)胞過表達 miR－129－2－3p后（miR－249－3p組），細(xì)胞數(shù)目顯著降低，且具有時間效應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 miR－219－2－3p過表達對ERK表達的影響 與陰性對照組相比，過表達 miR－219－2－3p后，細(xì)胞水平的磷酸化 ERK1／2（p－ERK）表達水平顯著降低，而總磷酸化水平?jīng)]有顯著改變，圖2。與癌旁組織相比，胃癌組織中p－ERK蛋白表達量顯著升高，見圖3。

表1 MiR－219－2－3p表達量與胃癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

圖2 MGC803細(xì)胞中過表達 miR－219－2－3p對細(xì)胞中P－ERK水平影響

圖3 胃癌組織和癌旁組織中P－ERK水平檢測

3 討 論

miRNA是一類小的非編碼RNA分子，由21～23個堿基組成。miRNA在真核基因表達調(diào)控中有著廣泛的作用，大多數(shù)已知的miRNA分子都是和基因的負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)。研究表明，miRNA可作為參與調(diào)控基因表達的分子，基于其靶mRNA分子，miRNA可以在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到“促進因子”或是“抑制因子”的作用［10－11］。胃癌中存在多種 miRNA表達的異常，這些miRNA通過對腫瘤相關(guān)靶基因的調(diào)控發(fā)揮作用，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移等過程中進行分子水平調(diào)控，影響胃癌的最終發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［12］。因此，對胃癌中特異的miR－NA進行的研究可為胃癌的臨床診治提供重要的科學(xué)理論依據(jù)。

本文首先研究了miR－219－2－3p表達水平和胃癌的相關(guān)性。首先，運用real－time PCR的方法對胃癌組織及癌旁組織的miR－129－2－3p表達量進行了測定，并通過統(tǒng)計學(xué)的方法對不同階段不同類型的胃癌與miR－219－2－3p表達作了相關(guān)性分析，結(jié)果表明 miR－219－2－3p水平在晚期胃癌中顯著下降。在胃癌細(xì)胞系MGC803中過表達miR－219－2－3p后可抑制細(xì)胞的增殖速率，提示 miR－219－2－3p可能是一種腫瘤抑制因子。針對上述的實驗結(jié)果，作者進一步探討了 miR－219－2－3p可能存在的抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制。已有的研究表明ERK信號通路的激活在多種腫瘤組織中被激活，例如胃癌［13］、胰腺癌［14］、肺癌［15］。而目前在腫瘤細(xì)胞系上的相關(guān)研究也表明ERK信號通路的激活對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著調(diào)控作用［16］。為了研究miR－219－2－3p在胃癌中的作用是否與ERK信號通路相關(guān)，本研究在胃癌細(xì)胞系 MGC803中過表達miR－219－2－3p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p－ERK表達水平相比于空白對照組與陰性對照組顯著地下降，而總的ERK的表達量不變。說明在胃癌細(xì)胞系中過表達miR－219－2－3p抑制了ERK信號通路。同時，在胃癌組織樣本中，其p－ERK表達水平相對于周圍癌旁組織也有顯著上升。因此，miR－219－2－3p可能是通過下調(diào)ERK信號通路的活性從而產(chǎn)生對胃癌細(xì)胞的抑制作用。

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