陳德鳳，齊魯楠，彭 濤，羅國容，黎樂群△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，廣西南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一［1］，其發(fā)病率在中國呈逐年上升趨勢，2007年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)肝癌死因位于惡性腫瘤死因的第二位，并且乙型肝炎病毒（HBV）的高感染率和黃曲霉毒素B1（AFB1）的高暴露是原發(fā)性肝癌高發(fā)的主要因素 之一［2－3］。有研究表 明［4］，βcatenin基因突變與肝癌發(fā)生有關(guān)，而HBV與AFB1的高暴露均能夠?qū)е娄拢璫atenin基因的突變并同時(shí)影響β－catenin蛋白的磷酸化。9.5%肝癌患者抑癌基因第10號染色體缺失與PTEN基因存在第4、5和8外顯子的突變［5］。肝癌的發(fā)生是一個(gè)多基因和多步驟的過程，肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中HBV與AFB1可能共同作用促使β－catenin基因和PTEN基因發(fā)生改變，為探索HBV和AFB1不同暴露情況下β－catenin基因和PTEN基因mRNA表達(dá)與HCC的關(guān)系，本研究運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）法從基因水平檢測β－catenin和PTEN 基因表達(dá)情況，為HBV及AFB1高暴露的地區(qū)開展HCC的預(yù)防和早期診療研究提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 108例HCC組織標(biāo)本收集于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一附屬醫(yī)院肝膽外科和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的標(biāo)本庫，標(biāo)本時(shí)間為2008年5月至2010年7月，同時(shí)設(shè)正常對照組20例，取自正常肝組織標(biāo)本，主要為肝血管瘤、肝外傷、肝移植供體標(biāo)本。手術(shù)標(biāo)本的病例包括男95例，女13例；年齡28～78歲，平均48.6歲；肝癌直徑為2.0～16.5cm，平均6.8cm。HBV暴露陽性標(biāo)準(zhǔn)為血清中HBsAg（＋），AFB1暴露標(biāo)準(zhǔn)為癌組織中AFB1－DNA加合物免疫組織化學(xué)陽性［6］。根據(jù)上述檢測結(jié)果以及研究目的，108例HCC患者根據(jù)HBV與 AFB1的暴露情況，分為4組，A組：HBV（＋）／AFB1（＋）48例；B組：HBV（＋）／AFB1（－）27例；C 組：HBV（－）／AFB1（＋）19例；D組：HBV（－）／AFB1（－）14例。所有患者術(shù)前均未接受放化療處理，術(shù)后病理診斷均證實(shí)為HCC，所有選取的病例均履行告知義務(wù)并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 AFB1－DNA加合物檢測方法 免疫組織化學(xué)染色：參照Santella等［7］的染色步驟。需同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對照（對照組的大鼠肝組織均由美國哥倫比亞大學(xué)Regina M.Santella教授惠贈(zèng)）。陽性對照取1年雄性SD大鼠行腹腔注射AFB11.0mg／kg和2.5mg／kg劑量，2h后處死取大鼠肝組織，未行腹腔注射AFB1的大鼠肝組織作為陰性對照。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后在顯微鏡下觀察，陽性定義標(biāo)準(zhǔn)為切片背景清晰同時(shí)肝細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紫黑色點(diǎn)狀顆粒。陰性定義標(biāo)準(zhǔn)為在肝細(xì)胞核內(nèi)無紫黑色點(diǎn)狀顆粒。

1.2.2 RT－PCR法檢測β－catenin與PTEN 基因的表達(dá)

1.2.2.1 癌組織總RNA的提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 以Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測OD值，計(jì)算RNA含量和純度。用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。根據(jù)Genebank中公布的人β－catenin基因、PTEN 和GAPDH 基因的 mRNA序列，使用Primer Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并使用BLAST驗(yàn)證為基因的特異性引物（各基因的正義引物和反義引物序列均跨至少一個(gè)內(nèi)含子）。

1.2.2.3 PCR反應(yīng)條件 將各試劑按順序加入到PCR反應(yīng)管中并混合后分裝，每管的總反應(yīng)體系為25μL。所用試劑為北京天根公司2×Tap PCR MasterMix，包括：2×MasterMix 12.5μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板10～100ng，滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件：β－catenin 基因：95℃預(yù)變性5 min；變性95℃30s，退火54℃40s，延伸72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PTEN基因：95℃預(yù)變性5min；變性95℃30s，退火57℃40s，延伸72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。GAPDH基因反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；變性95℃30s，退火55℃40s，延伸72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。以上反應(yīng)均終止于4℃。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物分析 將PCR產(chǎn)物電泳后的凝膠置于分析儀觀察，同時(shí)拍下圖片進(jìn)行分析。圖片結(jié)果采用Quantity One軟件分析基因的灰度值，平均灰度值減去背景灰度值之差為統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值，β－catenin基因與PTEN 基因的統(tǒng)計(jì)值為其灰度值與GAPDH 灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料的各組間均數(shù)比較，符合正態(tài)分布采用方差分析或成組設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 β－catenin基因mRNA的表達(dá)情況 RT－PCR結(jié)果顯示，β－catenin基因mRNA的平均半定量灰度值A(chǔ)組、C組分別與D組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，4個(gè)亞組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1、圖1。

表1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值比較（）

表1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值比較（）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與C組比較；d：P＜0.05，與D組比較。

48 1.13±0.14 B組 27 1.06±0.12 C組 19 1.16±0.18 D組 14 1.01±0.13ac正常對照組 20 0.85±0.13灰度值A(chǔ)組組別 n abcd

圖1 各組β－catenin mRNA半定量灰度值

2.2 PTEN基因mRNA的表達(dá)情況 RT－PCR的結(jié)果顯示，PTEN基因mRNA的平均半定量灰度值A(chǔ)組與C組及B組與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，A、B、D組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 各組PTENmRNA半定量灰度值比較（）

表2 各組PTENmRNA半定量灰度值比較（）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與D組比較。

48 0.54±0.13 B組 27 0.59±0.16 C組 19 0.97±0.16ab D組 14 0.92±0.13ab正常對照組 20 1.10±0.16灰度值A(chǔ)組組別 n abc

圖2 各組PTENmRNA半定量灰度值

3 討 論

本研究結(jié)果提示，β－catenin基因的高表達(dá)率可能與AFB1高暴露有關(guān)。AFT是寄生曲霉、黃曲霉等真菌的代謝產(chǎn)物，根據(jù)其細(xì)微結(jié)構(gòu)的不同可分為B1、B2、G1、G2、M1、M2等多種化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，在環(huán)境中廣泛存在，尤其在高溫潮濕地區(qū)的霉變食品中［8］。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1的毒性最強(qiáng)且對肝的致癌性最大［9］。AFB1致癌的可能機(jī)制是DNA損傷引起抑癌基因p53和癌基因ras突變，DNA損傷后DNA上出現(xiàn)堿基突變或堿基空缺，使p53的DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程受阻［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)AFB1高暴露組的β－catenin基因表達(dá)率顯著高于其他各組，C組的表達(dá)趨勢高于B組，作為單獨(dú)因素存在時(shí)，AFB1的效應(yīng)要高于 HBV，而β－catenin表達(dá)在A組中最高，則提示當(dāng)兩種因素同時(shí)存在時(shí)，對β－catenin表達(dá)可能具有協(xié)同效應(yīng)。Tien等［11］的研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞高及中分化的HCC中β－catenin 顯著增高，與本研究結(jié)果一致。Wnt／β－catenin 信號通路與腫瘤形成有關(guān)，通過轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾激活靶基因啟動(dòng)肝癌再生程序［12－13］。β－catenin 基因的高表達(dá)率可能是β－catenin在細(xì)胞膜的積聚影響細(xì)胞間的黏附，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生、發(fā)展。

在本研究中，在HBV高感染組中，PTEN基因的mRNA表達(dá)半定量灰度值低于其他各組，提示PTEN基因失活與HBV高感染率有關(guān)。PTEN是繼p53及Rb之后發(fā)現(xiàn)的重要抑癌基因，在多種惡性腫瘤中存在此基因表達(dá)降低［14－15］，PTEN在細(xì)胞內(nèi)的主要作用機(jī)制是影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平，通過其脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶發(fā)揮作用，PTEN低表達(dá)促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究中運(yùn)用RT－PCR技術(shù)檢測PTENmRNA表達(dá)的半定量灰度值在A組與B組中要顯著低于C組與D組。而前兩組的共同點(diǎn)均為HBV感染陽性。由此本研究推斷HBV的感染是導(dǎo)致PTEN基因失活的因素之一，HBV的影響途徑可能是通過引起PTEN的缺失來降低PTEN基因的表達(dá)。HBV／AFB1雙暴露的HCC中，PTEN的表達(dá)水平明顯下降，推斷與HBV和AFB1具有協(xié)同作用有關(guān)，而PTEN基因的表達(dá)下調(diào)則可能主要與HBV感染有關(guān)，AFB1對PTEN基因的表達(dá)下調(diào)可能有輔助協(xié)同作用。

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