田勝男，佟 巍，張麗芳，常 慧，李雨函，蘇靜芬，劉先菊，向志光，劉云波

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬杯狀病毒，是全球流行性與散發(fā)性急性胃腸炎的主要病因之一，每年至少導(dǎo)致100萬(wàn)例病患就診和20萬(wàn)例5歲以下兒童死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于缺少合適的體外培養(yǎng)模式和小動(dòng)物模型，使該病毒的研究受到了很大限制。小鼠諾如病毒的發(fā)現(xiàn)及其能夠在體外細(xì)胞中培養(yǎng)的特性，使它成為了良好的NoV研究模型[2]。小鼠諾如病毒在實(shí)驗(yàn)小鼠中的感染率非常高，我國(guó)已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施檢出小鼠感染該病毒的情況。

間接免疫熒光法基于抗原-抗體反應(yīng)，以全病毒作為抗原識(shí)別血清中存在的病毒抗體，因而具有高特異性[3]，該方法在實(shí)驗(yàn)小鼠病毒檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛，多種病毒都能夠通過(guò)這種方法進(jìn)行快速檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)旨在建立小鼠諾如病毒間接免疫熒光檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)MNV高效快速檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

RAW264.7細(xì)胞和MNV-1(CW1)購(gòu)自ATCC，Manassas, VA；Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM)購(gòu)自Thermo Scientific，Hyclone；四周齡Balb/c小鼠(SPF級(jí))購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)許可(ILAS-PC-2013-005)；小鼠諾如病毒ELISA檢測(cè)試劑盒(SMART-M35)購(gòu)自Biotech Trading Partners公司。熒光顯微鏡：Nikon, Ni-U；醋酸纖維素膜：Millipore, Bedford, USA；多通道雜交儀：AE-6195, ATTO, Tokyo, Japan；山羊抗小鼠IgG: Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA (1:10000用)；化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)：Millipore, Bedford, USA；X-ray 膠片：Kodak, Rochester, USA。

1.2 MNV-1的富集

取0.2 mL MNV-1，加入生長(zhǎng)密度為80%左右的單層RAW264.7細(xì)胞，37℃吸附1 h，加6 mL DMEM(含0.5%雙抗)，37℃, 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。分別取不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞反復(fù)凍融3次，2 500 r/min離心5 min，收集上清液。

1.3 TCID50法測(cè)定病毒效價(jià)

在離心管或12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋?zhuān)♂尪葟?0-1～10-10。將稀釋好的病毒懸液接種到鋪滿(mǎn)單層細(xì)胞的96孔微量培養(yǎng)板中(細(xì)胞密度約為2～3×105個(gè)/mL)，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100 μL。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排(100 μL生長(zhǎng)液)。逐日觀察并記錄結(jié)果，連續(xù)觀察7 d。按Reed-Muench兩氏法計(jì)算結(jié)果。

1.4 血清樣品的收集

取四周齡BALB/c 小鼠(SPF級(jí))進(jìn)行眼眶采血，收集血清作為陰性對(duì)照。其他小鼠通過(guò)灌胃的方式感染MNV-1(107TCID50)，200 μL/只[4]。取感染后7周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 免疫熒光分析抗體檢測(cè)

1.5.1 抗原片的制備：選擇效價(jià)為107TCID50的病毒接種于RAW264.7細(xì)胞，收集感染后不同時(shí)間細(xì)胞，滴加至玻片上，作為抗原孔。未感染的RAW264.7細(xì)胞作為對(duì)照孔。室溫晾干，將玻片浸入4℃預(yù)冷的丙酮中固定15 min，固定后通風(fēng)使丙酮揮發(fā)?？乖Ｆ?30℃保存。

1.5.2 檢測(cè)步驟：所有的血清樣品于56℃,滅活30 min，待檢血清用磷酸緩沖液(pH 7.2)1∶10稀釋樣品。每個(gè)樣品滴加2個(gè)孔(一個(gè)抗原孔，一個(gè)對(duì)照孔)。樣品滴加完畢后將玻片放入濕盒內(nèi)37℃孵育30 min。取出玻片，PBS沖洗3次，每次5 min?？乖ＦL(fēng)干后，逐孔滴加熒光結(jié)合物，放入濕盒內(nèi)37℃孵育30 min。PBS沖洗1次，蒸餾水沖洗1次。50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 ELISA試劑盒對(duì)小鼠血清的檢測(cè)

對(duì)收集的所有血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)(過(guò)程參照說(shuō)明書(shū))，選擇強(qiáng)陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.7 Western blot法對(duì)差異樣品的驗(yàn)證

對(duì)兩種方法檢測(cè)的結(jié)果不一致的血清，用Western blot的方法進(jìn)行驗(yàn)證。按1.2方法對(duì)MNV-1進(jìn)行富集后，30 000 r/min，3 h超速離心，PBS重懸沉淀，NanoDrop 2 000測(cè)定蛋白濃度；制備SDS-PAGE凝膠，每孔上樣5 μL，恒流100 V電泳2 h，電泳結(jié)束后立即轉(zhuǎn)膜，恒流300 A，1 h將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜(NC)上，3%脫脂奶粉封閉1 h，將差異血清1∶100稀釋后孵育NC雜交膜，4℃過(guò)夜，PBST(PBS含0.05%吐溫)洗膜3次，每次10 min，山羊抗小鼠IgG 1∶10 000稀釋后 37℃孵育NC雜交膜1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間收集病毒的滴度

對(duì)感染MNV-1后不同時(shí)間點(diǎn)的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行病毒收集并測(cè)定其效價(jià)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)前期病毒感染細(xì)胞以及初始復(fù)制較慢需要6～8 h左右，病毒滴度僅為102TCID50，隨后的24～28 h病毒滴度呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨著時(shí)間的增加，病毒效價(jià)明顯增強(qiáng)，培養(yǎng)時(shí)間增至36 h時(shí)病毒效價(jià)達(dá)到峰值，隨后的幾小時(shí)內(nèi)病毒滴度無(wú)上升趨勢(shì)，此時(shí)感染細(xì)胞基本呈破碎或半破碎狀態(tài)(圖1)。

使用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以2 h為間隔，收集病毒感染后2 h、8 h、12 h、16 h、20 h、22 h、24 h、36 h、48 h共9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的感染細(xì)胞爬片，分別檢測(cè)MNV陽(yáng)性血清并比較結(jié)果。全視野觀察36 h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)可至50%，視野中細(xì)胞形態(tài)清晰，熒光強(qiáng)度高，便于觀察。選擇感染病毒36 h的細(xì)胞用于IFA 檢測(cè)。

注：RAW264.7細(xì)胞感染MNV-1后不同時(shí)間點(diǎn)收集病毒并測(cè)定其效價(jià)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)8 h后為102pfu,隨著時(shí)間的增加，病毒效價(jià)也逐漸增強(qiáng)，培養(yǎng)時(shí)間增至36 h時(shí)病毒效價(jià)達(dá)到峰值。

2.2 IFA方法對(duì)血清樣品的檢測(cè)

IFA結(jié)果顯示小鼠感染MNV-1 7 d內(nèi)血清樣品均為陰性，全視野下無(wú)熒光可見(jiàn)；感染后兩周時(shí)有陽(yáng)性血清檢出，視野下偶見(jiàn)微弱熒光，多存在于胞漿處，呈顆粒狀；3周后全部血清樣品均為陽(yáng)性(表1)。圖2為MNV免疫熒光法檢測(cè)血清樣品熒光顯微鏡下效果圖，其中圖2(a)為典型陽(yáng)性圖像，圖2(b)為典型陰性圖像(圖2見(jiàn)封底)。

表1 IFA法對(duì)小鼠感染MNV-1后不同時(shí)間血清檢測(cè)結(jié)果

表2 ELISA法對(duì)小鼠感染MNV-1后不同時(shí)間點(diǎn)血清檢測(cè)結(jié)果

2.3 ELISA 試劑盒對(duì)血清樣品的檢測(cè)

圖3 ELISA法對(duì)小鼠感染MNV-1后不同時(shí)間血清檢測(cè)結(jié)果

取不同感染時(shí)間的小鼠血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采5只小鼠血清樣品)，統(tǒng)計(jì)其吸光值(表2)，根據(jù)吸光值的結(jié)果計(jì)算出血清中抗體存在情況。小鼠感染MNV-1 16 h后，血清中的MNV-1抗體明顯增加，感染后兩周時(shí)血清可判定為陽(yáng)性，感染3周后，血清中抗體達(dá)到峰值，隨后有微弱的下降，4～7周數(shù)值無(wú)明顯變化(圖3)。

2.4 IFA法與ELISA法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

分別用IFA法與ELISA法檢測(cè)80份小鼠血清，IFA法測(cè)定陽(yáng)性27份，陰性53份，ELISA法測(cè)定陽(yáng)性32份，陰性48份。差異樣品用Western blot法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，5份差異血清中3份血清為弱陽(yáng)性，2份為陰性。兩種結(jié)果對(duì)比顯示IFA法檢測(cè)符合率為96.0%，ELISA法符合率為97.5%。

3 討論

隨著對(duì)小鼠諾如病毒的認(rèn)識(shí)逐漸加強(qiáng)，越來(lái)越多的設(shè)施中檢出到實(shí)驗(yàn)小鼠感染諾如病毒的情況。北美、歐洲、亞洲(韓國(guó)和日本)等地區(qū)均有實(shí)驗(yàn)小鼠感染MNV的報(bào)道，相關(guān)報(bào)道也見(jiàn)于我國(guó)上海、廣東等地區(qū)。研究表明小鼠諾如病毒能夠使小鼠發(fā)生一系列的炎癥反應(yīng)甚至死亡。因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的過(guò)程中，排除小鼠諾如病毒的干擾，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性非常必要[5]。

針對(duì)小鼠諾如病毒的檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法試劑盒已經(jīng)商品化，其快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)收到多個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用單位青睞，但其特異性較差。常規(guī)PCR法及也能夠有效的檢出小鼠諾如病毒的存在，尤其是real-time PCR的靈敏度可以達(dá)到幾十個(gè)甚至十幾個(gè)拷貝數(shù)[6]，由于不同種類(lèi)的小鼠諾如病毒序列間存在一定的差異，real-time PCR作為一種高度特異的檢測(cè)方法，可能無(wú)法同時(shí)滿(mǎn)足多種小鼠諾如病毒的檢測(cè)。

間接免疫熒光法是一種非常傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法，在免疫學(xué)、生物化學(xué)和熒光顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)標(biāo)記檢驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)時(shí)間短、操作容易、特異性好。檢測(cè)抗原是采用胞內(nèi)全病毒，具有較高的特異性不，但其靈敏度略有不足。ELISA法靈敏度高，對(duì)血清樣品的要求也高，微溶血或有其他雜微生物的污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果都有非常大的影響。

綜上所述，IFA法和ELISA法雖然都能夠?qū)π∈笾Z如病毒進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，但這兩種方法都不能夠完全真實(shí)的反應(yīng)出小鼠的感染情況，在對(duì)設(shè)施中的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行MNV排查時(shí)，建議采用IFA法或ELISA法作為初篩方法，對(duì)結(jié)果可疑的樣品，可采用Western blot法進(jìn)行驗(yàn)證，才能夠得出真實(shí)可靠的結(jié)果。

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