馮 穎，王芊芊，陸文昊，曹敏梁

(1. 浙江大學(xué)實驗動物中心， 杭州，浙江 310058；2. 臺州醫(yī)院生殖中心，臺州，浙江 317000)

C57BL/6J近交系小鼠以其特有的生理學(xué)特性，被廣泛用于制作轉(zhuǎn)基因小鼠。在轉(zhuǎn)基因小鼠制備、飼養(yǎng)及品系共享等過程中，容易造成病原微生物的感染。這些病原體不僅對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，對人類的健康也產(chǎn)生極大的威脅。因此，擁有標(biāo)準化的SPF級實驗小鼠是相關(guān)研究的基礎(chǔ)，而感染小鼠通過生物凈化方法達到SPF級標(biāo)準是目前唯一有效的技術(shù)手段，生物凈化方法主要包括剖宮取胎和胚胎移植。剖宮取胎操作相對簡單，但存在凈化不徹底和難以計算最佳剖宮時間等弊端；而胚胎移植則需要掌握扎實的胚胎移植技術(shù)。本實驗以C57BL/6J野生型雌鼠為實驗對象，對其注射不同劑量的孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促進腺激素(hCG) 進行超數(shù)排卵后，與剖宮取胎和胚胎移植兩種方法相結(jié)合，通過比較分析平均卵母細胞數(shù)、平均胚胎數(shù)、受精率、見栓率、胚胎移植成活率，為生物凈化提供優(yōu)化方案。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

4周齡SPF級C57BL/6J雌鼠108只，18～22 g，均來源于上海斯萊克實驗動物有限公司 [SCXK(滬)2007-0005]，按照SFP級標(biāo)準飼養(yǎng)于浙大實驗動物中心屏障系統(tǒng)，自由飲水，室溫(20±2)℃，光照12 h/d，(8∶00～20∶00)，經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺，CO2恒溫培養(yǎng)箱( Thermo )，體式解剖鏡(Olympus SZ61 )，養(yǎng)皿 ( 35 mm，60 mm，Corning )，酒精燈，相差顯微鏡(Nikon SM2645)，鑷子，口吸式移卵管；注射用血促性素(PMSG)、注射用絨促性素(HCG)購自寧波市三生藥業(yè)有限公司，其余試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 動物實驗

1.3.1 試驗分組：5周齡的C57BL/6J雌鼠108只，根據(jù)剖宮取胎、體外和體內(nèi)胚胎移植三種方法分為三個試驗，每個試驗四個劑量組，每組各12只，重復(fù)3次。

1.3.2 小鼠超排：下午4點，四組分別腹腔注射5 IU、7.5 IU、10 IU、15 IU的PMSG，48 h后分別注射相同劑量的HCG。試驗一：四組雌鼠注射HCG后，與同系性成熟雄鼠合籠，次日驗陰栓并記錄，18 d后進行剖宮取胎進行統(tǒng)計；試驗二：四組雌鼠注射HCG 15 h后，收集卵母細胞，進行體外受精及2-細胞胚胎移植；試驗三：四組雌鼠注射HCG后，與同系性成熟雄鼠合籠，次日驗陰栓并記錄，1.5 d后獲取體內(nèi)2-細胞胚胎并進行移植。

1.3.3 培養(yǎng)基準備：采卵前1 d，用直徑35 mm 培養(yǎng)皿做HTF培養(yǎng)滴，石蠟油覆蓋，放入37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.3.4 精子采集：取交配過的性成熟C57BL /6J雄鼠1只，頸椎脫臼處死，剪下附睪的上體部，用注射針刺破，擠出精子團放入HTF培養(yǎng)滴中，CO2培養(yǎng)箱中放置1 h 再行體外受精。

1.3.5 卵母細胞的收集：用頸椎脫臼法處死小鼠，剖宮取出輸卵管放入盛有M2培養(yǎng)液的表面皿中，顯微鏡下放入礦物油中，找到輸卵管膨大部，用解剖針稍刺破膨大部，將卵母細胞團引出，并導(dǎo)入到HTF培養(yǎng)基液滴中。

1.3.6 體外授精(IVF)：將培養(yǎng)1h 的精子懸浮液鏡下檢查精子活力和精子數(shù)量，用移液器吸取精液10 μL( 約含精子200個/μL) 放入培養(yǎng)滴中，加入卵母細胞 (50～100) 個，培養(yǎng)皿放CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，用預(yù)熱過的HTF培養(yǎng)滴清洗受精卵兩次，再放回CO2箱中過夜培養(yǎng)。

1.3.7 早期胚胎的形態(tài)學(xué)評價：培養(yǎng)24 h后的受精卵做鏡檢，統(tǒng)計2-細胞胚胎，未受精卵及異常卵。其中，2-細胞胚胎和未受精卵形態(tài)正常，具有完整的透明帶，不含空泡和碎片，胞質(zhì)明亮均一，屬于質(zhì)量好的卵；由于精子的活力，受精能力等原因，造成了一部分卵未受精，顏色發(fā)暗并帶有胞質(zhì)顆粒的卵判定為死亡卵；胞質(zhì)內(nèi)含有碎片、部分胞質(zhì)溶解判定為畸形卵；死亡卵和畸形卵都屬于異常卵。挑出正常發(fā)育的2-細胞胚胎，移植備用。

1.3.8 體內(nèi)2-細胞胚胎收集：在供體鼠見栓1.5 d后，將其頸椎脫處死，剪下雙側(cè)輸卵管，在超靜工作臺中用口吸管吸取約0.2 mL的M2培養(yǎng)液，一端插入輸卵管的傘口，將胚胎沖出。在鏡下收集形態(tài)正常且透明帶完整的2-細胞期胚胎，放入新鮮的M2 培養(yǎng)滴中，移植待用。

1.3.9 假孕小鼠的準備：將SPF級ICR雌鼠與ICR結(jié)扎雄鼠 1:1合籠，第二日驗栓，有陰栓的作為受體鼠。所有實驗均在浙江大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)完成。

1.3.10 2-細胞胚胎移植：用口吸管吸25枚胚胎，末端再吸一個指示性的小氣泡。受體小鼠用戊巴比妥麻醉，剃掉小鼠背左側(cè)小面積被毛，75%酒精消毒，透過皮膚看到脂肪墊的位置剪一個縱向切口，拉出脂肪墊，牽引出卵巢、輸卵管和子宮。用脂肪夾夾住脂肪墊，固定好卵巢和輸卵管。解剖鏡下，在輸卵管的喇叭口與壺腹部之間用維納斯剪刀剪一小口，再將移卵針朝壺腹部方向插入輸卵管中，將所有胚胎吹入左側(cè)輸卵管。以輸卵管中可見指示小氣泡作為胚胎全部吹入的標(biāo)志。將脂肪墊、卵巢、輸卵管一起放回腹腔中，縫合肌肉和皮膚。多余胚胎進行冷凍保存。

2 結(jié)果

2.1 剖宮取胎實驗結(jié)果

四組劑量超排后，通過剖宮取胎實驗結(jié)果見表1。從表中可知，5IU劑量組見栓率最高，見栓率和平均產(chǎn)仔數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。

2.2 體外胚胎的獲得及其胚胎移植結(jié)果

四組劑量超排后，體外胚胎的獲得以及移植結(jié)果見表2。從表2可知，4組劑量超排后平均卵母細胞數(shù)、異常卵率差異顯著(P<0.05)。其中，注射10 IU實驗組平均卵母細胞數(shù)為(30.33±0.89)枚，顯著高于其它3組，5 IU組的(23.44±0.51)枚、7.5IU組的(23.33±0.67)枚，顯著高于15 IU組的(17.33±0.34)枚；5 IU組劑量的異形卵率最低，為(3.79%±0.81%)，與7.5 IU劑量組(5.24%±0.84%)差異不顯著，與10 IU、15 IU組均差異顯著，15 IU組劑量的異形卵率最高，為(8.37%±0.92%)，與其它3組均差異顯著。四個劑量組的體外受精率差異不顯著(P>0.05)；體外受精平均2-細胞胚胎數(shù)顯著差異(P<0.05)，10 IU組最高為18.78±0.39枚，與其它三組均差異顯著，5 IU組和7.5 IU組差異不顯著，15 IU組最低，為13.00士0.33枚，均顯著低于其它三組；同時，將四組劑量超排后獲得的卵母細胞進行體外受精，將獲得的2-細胞胚胎進行移植，產(chǎn)仔率均差異不顯著(P>0.05)。

2.3 體內(nèi)2-細胞胚胎的獲得及其胚胎移植結(jié)果

四組劑量超排后，體內(nèi)2-細胞胚胎的獲得及其胚胎移植結(jié)果見表3。從表中看出，平均胚胎數(shù)差異顯著(P>0.05)，移植后產(chǎn)仔率差異不顯著(P>0.05)。其中，10 IU組獲得的平均胚胎數(shù)最多，為18.00±0.50枚，與其它3組均存在顯著差異；其次是5 IU組，也顯著高于其它兩組，而7.5 IU組和15 IU組之間差異不顯著。

表1 四組劑量超數(shù)排卵后剖宮取胎的結(jié)果

表2 四組劑量超數(shù)排卵后體外胚胎的獲得及其移植的結(jié)果

表3 四組劑量超數(shù)排卵后體內(nèi)胚胎的獲得及其移植的結(jié)果

3 討論

隨著C57BL /6J轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的廣泛應(yīng)用，其生物凈化工作也日漸頻繁。傳統(tǒng)的剖宮取胎法容易導(dǎo)致垂直傳播的病毒凈化失敗，但由于操作比較簡單，在不具備胚胎移植技術(shù)的條件下也是一種選擇。本文嘗試通過超排的方法達到人工控制發(fā)情。通過比較，雖然小鼠的見栓率和平均產(chǎn)仔數(shù)沒有顯著差異，但注射5 IU劑量組的小鼠交配后見栓率最高，該劑量適用于C57BL/6J背景鼠進行剖宮取胎生物凈化，提高其受孕率。因為高劑量的激素對小鼠的內(nèi)分泌會造成一定的紊亂，導(dǎo)致交配的失敗。因此，只要激素能激發(fā)小鼠發(fā)情，使它交配成功，激素量越少越好。實驗中發(fā)現(xiàn)，超排后合籠的小鼠有一部分見栓卻沒懷孕，有研究者發(fā)現(xiàn)大鼠相似的現(xiàn)象[1]。這主要是由于超排后，雌性動物體內(nèi)會出現(xiàn)高水平的雌二醇-17β，從而刺激輸卵管的運動性，加速了胚胎的遷移，導(dǎo)致胚胎過早暴露于不適合其發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，造成胚胎大量丟失[2]，不利于受精卵的發(fā)育和妊娠[3]。

相對剖宮取胎，采用胚胎移植法手術(shù)時間可控性強，可最大限度避免病毒經(jīng)胎盤感染仔鼠，仔鼠成活率高[4]，但它需要大量的胚胎，而胚胎的獲得分體內(nèi)和體外胚胎。如果有較多生殖狀態(tài)好的轉(zhuǎn)基因雄鼠，可超排野生型雌鼠與轉(zhuǎn)基因雄鼠交配，獲得體內(nèi)2-細胞胚胎進行移植。本次試驗中，注射10 IU組獲得的體內(nèi)胚胎數(shù)最多，為最佳劑量。但這種方法需要較多的轉(zhuǎn)基因雄鼠，而且一次沖出的胚胎數(shù)量受限，一般建議采用IVF。當(dāng)雄鼠不多或者狀態(tài)不好的情況下，更能體現(xiàn)出體外受精的優(yōu)勢。只需一只雄鼠，超排大量野生型雌鼠，一次獲得大量的卵進行IVF，獲得大量的體外受精胚，基本能一次完成凈化工作，節(jié)約成本，提高效率。本次注射10 IU劑量組能獲得最多的卵母細胞，這與部分文獻報道有所差異[5-7]，可能與所用激素、小鼠周齡不同以及品系間存在個體差異有關(guān)[8]。本文僅就注射不同劑量的激素對C57BL /6J小鼠進行超排，初步探討超排在C57BL/6J小鼠生物凈化體系中的應(yīng)用，但是超數(shù)排卵是一系列極為復(fù)雜的生理過程，影響因素很多[9-10]，其對胚胎發(fā)育和質(zhì)量的影響目前仍然說法不一[11-13]，有待今后進一步深入研究。

參考文獻：

[1] Goh HH, Yang XF, Tain CF, et al. Oogenesis, fertilization and early embryonic development in rats. I. Dose-dependent effects of pregnant mare serum gonadotrophins [J]. Ann Acad Med Singapore, 1992, 21(4):443-450.

[2] Ishigame H, Medan MS, Watanabe G, et al. A new alternative method for superovulation using passive immunization against inhibin in adult rats [J]. Biol Reprod, 2004, 71:236-243.

[3] 張家驊. 家畜生殖內(nèi)分泌學(xué)[M].北京:中國教育文化出版社, 2004:155-166.

[4] 劉麗均, 郁麗麗, 朱權(quán)鳳, 等．生物工程技術(shù)在實驗小鼠生物凈化上的應(yīng)用 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(11):63-66.

[5] 徐平. 不同日齡小鼠的超排、體外授精及二細胞胚胎移植的比較研究(簡報) [J]. 實驗生物學(xué)報, 2001, 34(3):253-255.

[6] Tsunode Y, Soma T, Sugie T. Frogen storage of rabbits and hamster embryos[A]/Zell marker H. Frogen stroage of laboratory animals [M]. New York: Gustave Fisecher Verlag, Stuttgart. 1981:129-138.

[7] Bogolyubova NA, Bogolyubova IO. Actin localization in nuclei of two-cell mouse embryos [J]. Cell Tissue Biol. 2009, 5:417-422.

[8] Eum JH, Park JK, Lee WS, et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling [J]. Fertil Steril. 2009, 91(5):1928-1932.

[9] Hassan AS, Hou J, Wei W, et al. Expression of two novel transcripts in the mouse definitive endoderm [J]. Gene Expr Patterns,2010, 10(2-3):127-134.

[10] Wang Z, Xu L, He F. Embryo vitrification affects the methylation of the H19/Igf2 differentially methylated domain and the expression of H19 and Igf2 [J]. Fertil Steril, 2010, 93(8):2729-2733.

[11] Bourgain C, Devroey P. The endometrium in stimulated cycles for IVF [J]. Hum Reprod Update, 2003, 9(6):515-522.

[12] Ertzeid G, Storeng R. The impact of ovarian stimulation on implantation and fetal development in mice [J]. Hum Reprod, 2001, 16(2):221-225.

[13] Combelles CM, Albertini DF. Assessment of oocyte quality following repeated gonadotropin stimulation in the mouse. [J]. Biol Reprod, 2003, 68(3):812-821.