張 寶，刑 博，魏曙光，賈小妮，張洪波，李生斌

(西安交通大學醫(yī)學部法醫(yī)學院衛(wèi)生部法醫(yī)學重點實驗室，環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室，陜西 西安 710061)

多巴胺是主要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，它控制著運動、認知、攝食、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種功能[1, 2]。在腦內(nèi)，多巴胺主要通過多個神經(jīng)環(huán)路系統(tǒng)發(fā)揮功能[3, 4-6]。環(huán)路之一即由下丘腦結(jié)節(jié)漏斗部投射到垂體，多巴胺通過與受體結(jié)合調(diào)控泌乳素的分泌[7]，從而參與調(diào)控機體的生長發(fā)育。作為G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，多巴胺受體可分為D1樣(D1和D3)和D2樣(D2、D3和D4)兩大類。研究發(fā)現(xiàn)多巴胺通過與受體結(jié)合對食物相關信號刺激、瘦素、生長激素釋放肽及其它影響該系統(tǒng)活性的食欲相關調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生應答。

多巴胺D1或D3受體的拮抗劑與其它D1樣或D3樣受體存在一定的選擇性結(jié)合[8, 9]，很難區(qū)分不同受體的功能及它們間的相互作用。直至90年代出現(xiàn)敲除小鼠模型后，多巴胺D1、D3受體介導的許多行為特性才得以發(fā)現(xiàn)[10]。為深入的研究多巴胺受體介導的神經(jīng)及生理活動，我校法醫(yī)學實驗室從芝加哥大學引進以C57BL/6為遺傳背景的多巴胺D1受體敲除(D1-/-)小鼠和D3受體敲除(D3-/-)小鼠[8, 11]，并在這兩系基因敲除小鼠基礎上，繁育出多巴胺D1和D3受體雙基因敲除(D1-/-D3-/-)小鼠。通過飼養(yǎng)繁育敲除小鼠，探討D1-/-小鼠、D3-/-小鼠及D1-/-D3-/-小鼠與野生型在進食、飲水、體重增長等方面的差異，為利用基因敲除小鼠研究多巴胺D1、D3受體的功能及它們之間的相互作用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

引進及培育的D1-/-小鼠、D3-/-小鼠、D1-/-D3-/-小鼠和野生型(WT)小鼠飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心按照無特異病原(specific pathogen free, SPF)級標準飼養(yǎng)。室內(nèi)溫度控制在18°C～22°C，濕度50%～60%。實驗動物生產(chǎn)合格證號為：SCXK(陜)2012-003；實驗動物使用合格證號為：SYXK(陜)2012-005

1.2 不同基因型小鼠進食、飲水、體重變化的比較

1.2.1 不同基因型小鼠進食、飲水情況比較：選取D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-與WT四種基因型雄鼠各7只，對其30 d、50 d、70 d 小鼠早晨10點通過電子天平稱量前后2d的食物量及飲水量差別，對24 h內(nèi)的進食量和飲水量進行測量，數(shù)據(jù)精確到0.01 g。

1.2.2 不同基因型小鼠體重比較：對以上選取的D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-與WT四種基因型雄鼠早晨10點對21 d(斷乳時)、35 d、60 d、90 d的小鼠通過電子天平稱量前后體重差別，進行比較，數(shù)據(jù)精確到0.01 g。

1.2.3 統(tǒng)計分析：分析各基因型小鼠間的統(tǒng)計學差異和各時間點敲除鼠與對照組的差別，采用單因素方差分析 (one-way analysis of variance，ANOVA)，通過Student-Newman-Keuls檢驗，進行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同日齡D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-與WT小鼠進食量比較

如圖1所示，不同基因型小鼠進食量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：30 d時D1-/-小鼠、D1-/-D3-/-小鼠、D3-/-小鼠均比WT小鼠進食量低，且D1-/-小鼠、D1-/-D3-/-小鼠較WT小鼠差異有顯著性(D1-/-vs. WT：**P<0.001； D1-/-D3-/-vs. WT：##P<0.001)，D3-/-小鼠和WT小鼠相比進食量無統(tǒng)計學差異；50 d所有基因型進食量均無統(tǒng)計學差異；70 d時D3-/-小鼠進食量顯著高于WT小鼠(D3-/-vs WT：&&P<0.001)，其他組間差異無顯著性。

在30 d和50 d之間D1-/-小鼠進食量呈明顯上升趨勢，且D1-/-D3-/-小鼠進食量介于D1-/-小鼠和D3-/-小鼠之間；在50 d和70 d之間D3-/-小鼠進食量有一個顯著上升趨勢；WT小鼠在此階段進食量呈下降趨勢。

圖1 各基因型小鼠在不同日齡24 h進食。

2.2 不同日齡D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-與WT小鼠飲水量比較

如圖2所示，不同基因型小鼠飲水量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：與WT小鼠相比，D1-/-小鼠和D1-/-D3-/-小鼠在30 d(D1-/-vs WT：**P<0.001；D1-/-D3-/-vs WT：##P<0.001)、50 d(D1-/-vs WT：**P<0.001；D1-/-D3-/-vs WT：##P<0.01)以及70 d(D1-/-vs WT：**P<0.01；D1-/-D3-/-vs WT：##P<0.001)飲水量均顯著性較低，30 d至50 d逐漸增長，50 d飲水量達到最高，之后下降；D3-/-小鼠在30 d至50 d之間飲水量與WT小鼠一樣呈下降趨勢，與WT小鼠不同的是，50 d至70 d之間WT小鼠飲水量依舊呈下降趨勢，而D3-/-小鼠呈上升趨勢，且在70 d明顯高于WT小鼠(D3-/-vs WT：&&P<0.001)。

圖2 各基因型小鼠在不同日齡24 h飲水量。

2.3 D1-/-、D3-/-、D1-/-D3-/-與WT小鼠不同日齡階段體重增長比較

如圖3所示，不同基因型小鼠體重增長統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：四種基因型小鼠在90 d前體重曲線均呈現(xiàn)上升趨勢。21 d，三種基因缺陷小鼠與WT小鼠相比體重較小，且均有顯著性差異(D1-/-vs. WT：**P<0.001；D3-/-vs. WT：&&P<0.01；D1-/-D3-/-vs. WT：##P<0.001)；21 d至35 d，D3-/-小鼠和D1-/-D3-/-小鼠體重急劇上升；D3-/-小鼠除21 d外，其它時間點均與WT體重無差別；D1-/-D3-/-小鼠在60 d以后與WT小鼠體重無統(tǒng)計學差異；而D1-/-小鼠直至90 d體重才與WT小鼠無統(tǒng)計學差異；90 d 時，各基因型小鼠體重間無統(tǒng)計學差異。

3 討論

人類幾乎所有的疾病都與基因有關，基因敲除動物模型的建立，為研究人類疾病提供了一個嶄新方法，尤其是遺傳性疾病[12]。應用小鼠來復制動物模型是最經(jīng)濟最理想的[13]，本研究引進并繁育D1-/-和D3-/-小鼠后，培育出D1-/-D3-/-小鼠，完全按照SPF級動物飼養(yǎng)標準進行，為研究多巴胺受體介導的神經(jīng)及生理活動制作本動物模型。同以往研究結(jié)果相同，繁育的小鼠后代基因型分布基本符合孟德爾定律[8, 11]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦在攝食行為、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和生理特性改變方面起到了關鍵的調(diào)節(jié)作用[14]，多巴胺通路會對食物適口性、食物相關性信號刺激、瘦素、生長激素釋放肽及其它影響該系統(tǒng)活性的食欲相關調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生應答[15-18]。提示大腦多巴胺系統(tǒng)在食物的攝取過程中發(fā)揮重要作用[19-21]。通過與受體相結(jié)合，多巴胺發(fā)揮生物學作用。本研究發(fā)現(xiàn)，各類型缺陷小鼠斷乳體重均顯著低于WT小鼠，而后呈上升趨勢，35 d時D3-/-與WT小鼠體重無統(tǒng)計學差異；D1-/-D3-/-小鼠體重在60 d時與WT小鼠趨于一致，而D1-/-小鼠體重直到90 d時與WT小鼠趨于一致。該實驗結(jié)果提示：多巴胺通過D1、D3受體發(fā)揮相關作用，對小鼠斷乳和35 d體重增長有一個較為顯著的影響，可能由于哺乳期多巴胺D1、D3受體直接或間接地對母鼠的泌乳產(chǎn)生影響，導致仔鼠斷乳體重較小，斷乳后進食量顯著上升，體重隨之呈代償性增加[7]。

本研究中，D1、D3受體基因敲除后，通過影響多巴胺的生物學效應，進而影響仔鼠斷乳體重。近年來，文獻報道母犬舔舐子犬或飼喂子犬時，紋狀核多巴胺大量釋放；個體紋狀核多巴胺的釋放水平與母犬舔舐和飼喂行為顯著相關[ 22, 23]。同時研究報道，紋狀核損傷或注射多巴胺受體拮抗劑可影響泌乳等母性行為[ 24, 25]。因此，本文中，多巴胺D1，D3受體敲除對小鼠體重的影響可能有兩方面因素，一是受體敲除后，通過多巴胺而調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸的活性，從而調(diào)控仔鼠的覓食與飽腹感，最終影響仔鼠初生重及泌乳期體重。二是多巴胺D1、D3受體基因的敲除可能通過干擾多巴胺活性調(diào)控泌乳等母性行為，進而影響小鼠的體重。多巴胺D1、D3受體如何影響小鼠泌乳導致體重增長變化的具體分子生物學機制，有待于進一步深入研究。

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