王 也，吳方楠，周伊婷，鞠秀峰，湯在祥

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，遺傳流行病與基因組學(xué)研究中心，蘇州，江蘇 215123)

生物性狀的表達(dá)有賴(lài)于基因間的上位性作用，上位性作用構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)了幾乎全部的基因表達(dá)[1]。目前研究人員已經(jīng)發(fā)展出一系列解析核內(nèi)基因間上位性的統(tǒng)計(jì)模型和分析方法，在實(shí)際研究中也檢測(cè)到了具有顯著上位性的基因[2]。隨著對(duì)復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)研究的不斷深入，細(xì)胞質(zhì)環(huán)境對(duì)于基因表達(dá)的影響作用正在受到研究人員的關(guān)注。在模式生物上線(xiàn)粒體與細(xì)胞核間的上位性效應(yīng)對(duì)性狀表達(dá)有明顯的影響[3-5]，核質(zhì)之間的緊密聯(lián)系多次得到了證實(shí)。雖然這些研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)復(fù)雜性狀的遺傳表達(dá)以及核質(zhì)互作遺傳機(jī)制提供了一定的依據(jù)，然而，如何在分子水平上探明核質(zhì)互作的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，仍然有待研究。長(zhǎng)期以來(lái)，由于相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的缺乏，核質(zhì)上位性在復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳中的重要性常常被研究人員忽視[6]。尚沒(méi)有將核質(zhì)互作效應(yīng)在分子水平上作進(jìn)一步的遺傳剖析，因而，無(wú)法追蹤在一定細(xì)胞質(zhì)背景下哪些基因表達(dá)，表達(dá)的基因所在位置，表達(dá)效應(yīng)的方向和大小，以及重要的核質(zhì)上位互作效應(yīng)等。

Tang等[7]在2007年較早地提出核質(zhì)互作的quantitative trait locus (QTL)分析思想，在分離群體中引入細(xì)胞質(zhì)變異，即將雙親雜交衍生的正交分離群體和反交分離群體進(jìn)行混合分析，有效地分解控制復(fù)雜性狀的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)、核內(nèi)QTL效應(yīng)以及QTL和細(xì)胞質(zhì)的互作效應(yīng)。本研究將在前期研究工作的基礎(chǔ)上[7-9]，擬進(jìn)一步改善該模型和方法，并以公開(kāi)發(fā)表的小鼠膽固醇含量等復(fù)雜性狀的數(shù)據(jù)為例，展示該分析方法和模型的有效性和實(shí)用性,并在現(xiàn)有數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新的遺傳機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 遺傳設(shè)計(jì)

本研究采用QTL Archive 網(wǎng)站上的公共數(shù)據(jù)，其遺傳設(shè)計(jì)如下：取DBA/2J (D2)和CAST/EiJ (CAST)兩種品系的小鼠，采用正反遺傳交配設(shè)計(jì)。親代小鼠以及F1和F2均在相同的環(huán)境條件下飼養(yǎng)繁殖[10,11]。F1代小鼠由D2和CAST兩種品系的小鼠相互交配產(chǎn)生，兩種雜交形式為CAST(父本)×D2(母本)和D2(父本)×CAST(母本)。F2代由F1代個(gè)體隨機(jī)組合交配產(chǎn)生。遺傳設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 正反雜交遺傳設(shè)計(jì)

1.2 表型數(shù)據(jù)收集和分析

根據(jù)原作者描述，研究采用了F2代小鼠全部為雄性，共278只，年齡在16～18周。F2代小鼠生長(zhǎng)至6～8周后進(jìn)行連續(xù)十周的高脂肪飲食喂養(yǎng)[12]，實(shí)驗(yàn)前禁食4 h后眼窩靜脈竇進(jìn)行采血。血液在4℃環(huán)境下保存，然后通過(guò)離心(1 000 r/min，5 min)將血漿分離，在分析前儲(chǔ)存在-20℃環(huán)境下。采用自動(dòng)生化分析儀及配套的試劑對(duì)高密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇進(jìn)行分析[13,14]。非高密度脂蛋白通過(guò)計(jì)算總膽固醇與高密度膽固醇之間的差值而確定。

1.3 DNA標(biāo)記

采用在DBA/2J (D2)和CAST/EiJ (CAST)小鼠間具有多態(tài)性的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，其數(shù)量選擇依染色體長(zhǎng)度而定。標(biāo)記間平均遺傳距離約20 cM, 覆蓋小鼠除性染色體以外全部19條染色體。

1.4 原理

(1)

記Xj=(1xcjx1jx2jx3jx4j)為一行向量，b=(b0cadiaciad)Τ，則模型(1)可以矩陣語(yǔ)言表示為：

(2)

表1 個(gè)體基因型及基因型值組成分量

(3)

(4)

以上二式中的“E”表示有關(guān)缺失變量的期望值，其計(jì)算方法概述如下：

(7)

(8)

進(jìn)而有EM算法實(shí)現(xiàn)的極大似然估計(jì)步驟如下：

(4)重復(fù)(2)和(3)兩步，直至收斂為止。收斂時(shí)的參數(shù)估計(jì)值即為相應(yīng)參數(shù)的極大似然估計(jì)值。

1.4.3 似然比檢驗(yàn)：本研究主要進(jìn)行兩方面檢驗(yàn)，首先是是否有無(wú)QTL的檢驗(yàn)，其次是關(guān)于該QTL是否存在核質(zhì)交互作用的檢驗(yàn)，具體如下：

(9)

上式中的Xj=(1xcj)。獲得相關(guān)參數(shù)估計(jì)值后，計(jì)算H0假設(shè)下的對(duì)數(shù)似然函數(shù)值L0為：

其中

而H1下的對(duì)數(shù)似然函數(shù)lnL1，則以模型(1)中相應(yīng)參數(shù)的極大似然估計(jì)值代入(4)式計(jì)算獲得，從而有似然比測(cè)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量：

(10)

用于測(cè)驗(yàn)H0，該統(tǒng)計(jì)量服從自由度為4的χ2分布。

(11)

該統(tǒng)計(jì)量服從自由度為2的χ2分布。

1.4.4 核質(zhì)互作QTL定位：在進(jìn)行QTL定位和核質(zhì)上位性分析時(shí)，首先利用(9)進(jìn)行全基因組搜索，獲得QTL的似然圖譜，并以之推斷各染色體上是否存在QTL，以及各個(gè)QTL可能的位置，然后進(jìn)一步進(jìn)行似然比檢驗(yàn)，確定該QTL是否存在顯著的基因型效應(yīng)，以及QTL與細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)是否存在上位性效應(yīng)。本研究以L(fǎng)OD值3.0為顯著性的閾值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)差異顯著性分析

細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)分析，采用正反交之間比較，膽固醇相關(guān)性狀指標(biāo)的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)分析見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，僅HDL在不同的細(xì)胞質(zhì)背景下呈現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)，該結(jié)果暗示了細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)的存在，為進(jìn)一步進(jìn)行核質(zhì)互作QTL分析奠定了基礎(chǔ)。需要指出的是，細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)不顯著，并不表示不存在QTL與細(xì)胞質(zhì)背景的互作效應(yīng)。

2.2 核質(zhì)互作QTL定位

圖2～圖4展示了3個(gè)性狀全基因組掃描的結(jié)果，該結(jié)果表明，CHOL在第9染色體上存在一個(gè)QTL，HDL在第2,4,6染色體上共有4個(gè)QTL，nonHDL在第9染色體上存在1個(gè)QTL，各個(gè)QTL的參數(shù)估計(jì)見(jiàn)表3。采用上述顯著性檢驗(yàn)方法，對(duì)各個(gè)QTL是否存在顯著核質(zhì)互作效應(yīng)進(jìn)行了檢驗(yàn)，表中LOD1為QTL似然比檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，LOD2為QTL與細(xì)胞質(zhì)交互作用似然比檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，該統(tǒng)計(jì)量大于3.0表示，存在QTL或存在顯著的核質(zhì)互作效應(yīng)。結(jié)果表明在第6染色體上，影響HDL的一個(gè)QTL存在顯著核質(zhì)效應(yīng)，且以加性與細(xì)胞質(zhì)互作效應(yīng)為主。在第9染色體上，影響CHOL的QTL也存在較大的核質(zhì)互作效應(yīng)，盡管沒(méi)有通過(guò)顯著性檢驗(yàn)，仍然提示可能存在核質(zhì)交互作用。

表2 F2群體血漿總膽固醇、高密度脂蛋白、非高密度脂蛋白濃度分析

表3 核質(zhì)互作QTL定位結(jié)果

圖2 小鼠總膽固醇量各連鎖群QTL定位的似然圖譜

圖4 小鼠非高密度脂蛋白各連鎖群QTL定位的似然圖譜

3 討論

本研究改進(jìn)了業(yè)已構(gòu)建的核質(zhì)互作統(tǒng)計(jì)遺傳模型，增加了對(duì)核質(zhì)效應(yīng)的檢驗(yàn)，有利于發(fā)掘具有顯著核質(zhì)互作效應(yīng)的基因。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，分析了小鼠正反F2家系數(shù)據(jù)，不僅驗(yàn)證了前任研究的結(jié)果，而且進(jìn)一步明確了有關(guān)QTL的核質(zhì)互作作用，為進(jìn)一步解釋相關(guān)性狀的核質(zhì)互作機(jī)制奠定了初步的研究結(jié)果。

在前人的研究結(jié)果中[16-18]，對(duì)CHOL，HDL和nsn-HDL 3個(gè)性狀，采用常用的區(qū)間作圖方法共定位到了6個(gè)QTL。它們分別是影響CHOL的QTL，位于第9染色體第8 cM位置的Chol6；影響HDL的4個(gè)QTL，分別位于第2染色體上48 cM處Hdl1，第4染色體的20 cM處Hdlq10，以及第6染色體的48 cM 處的Hdl11，和68 cM位置上的Hdl12；影響n(yōu)on-HDL的QTL，位于第9染色體8 cM處Chol6。本研究QTL的定位于上述QTL定位結(jié)果相似，特別是在QTL位置的置信區(qū)間上相互重疊。這證明了本研究的模型方法以及分析結(jié)果正確性，也說(shuō)明了這些QTL的事實(shí)存在。因此，本研究的意義在于，采用新的統(tǒng)計(jì)遺傳模型發(fā)掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)，并得出新的結(jié)論，為進(jìn)一步全面深入了解小鼠復(fù)雜性狀的遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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