李楓棣，鮑琳琳，朱 華，鄧 巍，許黎黎，呂 琦，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(avian influenza viruse，AIV)感染引起的禽類全身性或呼吸器官性傳染病[7]。禽流感病毒(AIV)屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個(gè)型，其中，甲型流感病毒依據(jù)血凝素(HA)的不同再分為1～16亞型，根據(jù)病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同再分為1～9亞型，HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一些亞型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類；乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染,引起禽流感綜合征的A型流感病毒稱之為禽流感病毒[1]。禽流感病毒是引起禽類一種急性高度接觸性傳染病, 屬于甲型流感病毒中的多種亞型。1878年意大利首次報(bào)道了禽流感。禽類特別是水禽是所有這些流感病毒的自然宿主，H7N9亞型禽流感病毒是其中的一種。H7N9亞型禽流感病毒既往僅在禽類中發(fā)現(xiàn)，荷蘭、日本及美國等地曾發(fā)生過禽間暴發(fā)疫情，但未發(fā)現(xiàn)過人的感染。2013年3月，上海、浙江以及安徽等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)人感染H7N9亞型禽流感病毒[2]。本文旨在通過全基因組序列測定及比對，對H7N9禽流感病毒在小鼠體內(nèi)的適應(yīng)性進(jìn)行研究，并對其毒力與致病力進(jìn)行討論。

圖1 小鼠感染禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒后第4天肺組織中病毒載量

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：4周齡SPF級雌性BALB/C小鼠36只,體重9～11 g，來自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心(SCXK-(軍)2007-005)。

1.1.2 毒株：禽流感H7N9病毒A/Anhui/1/2013，由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)場所：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所ABSL-3實(shí)驗(yàn)室(注冊號：CNAS BL0010)。

1.2 方法

1.2.1 將動物分成9組，每組3只，以滴鼻方式進(jìn)行攻毒，50 μL/只，第一次攻毒使用毒株為禽流感H7N9病毒A/Anhui/1/2013， 106TCID50/50 μL。攻毒后第4天摘眼球取血，安樂后解剖取肺組織，生理鹽水涮洗后剪成2 mm左右小塊，放入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中稍作研磨后3 000 r/min離心取上清，進(jìn)行再次滴鼻攻毒，50 μL/只，直至第9代。

1.2.2 病毒載量測定：使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)試劑盒提取每一代小鼠肺組織勻漿上清的總RNA，并及時(shí)分裝保存于-80℃。使用 Superscript Ⅲ (Invitrogen) 試劑盒對RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，取2 μL樣品進(jìn)行SYBR Green染料法熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測。Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)在 StepOne PCR system (ABI)上進(jìn)行，總反應(yīng)體積為20 μL，其中：去離子水6 μL， 2× SYBR Green PCR Master Mix (ABI) 10 μL, 10 μM 的上，下游引物各1 μL，引物序列為：

InfA-F: 5′-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3′;

InfA-R: 5′-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3′。

Real-time PCR反應(yīng)條件為：94℃ for 3 min(×1)，94℃ 30 s(×35)，58℃ 30 s(×35)， 72℃ 30 s(×35)。

1.2.4 基因組測序和比對：對所有的野生型和適應(yīng)株病毒的基因片段進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增(KOD plus DNA polymerase, TOYOBO)。PCR 產(chǎn)物純化和測序后使用CLUSTAL W (version 1.83)軟件進(jìn)行比對。

2 結(jié)果

2.1 病毒載量測定

感染野生型和鼠肺適應(yīng)株病毒的小鼠在感染后第4天解剖，肺組織中均檢測到病毒載量，載量一直保持在接近同一數(shù)量級。結(jié)果如圖1所示：

2.3 基因比對

經(jīng)過基因比對發(fā)現(xiàn)小鼠適應(yīng)株P(guān)1的NA蛋白，P9的HA蛋白,NA蛋白以及PA蛋白共發(fā)生4處突變，分別為：HA蛋白143位的Ala突變?yōu)門hr；NA蛋白10位的Thr突變?yōu)閘le，168位的Ser突變?yōu)镮le；PA蛋白4位的Phe突變?yōu)镃ys其余基因未出現(xiàn)突變情況。具體結(jié)果如表1所示。

表1 禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒及小鼠適應(yīng)株基因比對結(jié)果

3 討論

流感病毒屬RNA病毒類的正黏病毒科，是引起呼吸道感染的重要病原體[2]。流感病毒所致呼吸道感染是臨床常見病、多發(fā)病，常引起地方性流行，有時(shí)可致世界性大流行。因?yàn)樾∈笈c人類在肺炎上病理表現(xiàn)的一致性[4]，基于流感病毒的小鼠模型為近年來研究病毒的致病機(jī)制、病毒跨物種傳播、病毒重組預(yù)測、新型流感病毒疫情預(yù)測、治療方案的評價(jià)、藥物和疫苗的篩選評價(jià)等方面的研究的重要工具之一[5]。許多相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道過很多影響流感病毒毒力的因素，血凝素HA是影響病毒毒力的主要因素之一[5]； NA蛋白莖部0～52個(gè)氨基酸變化與流感病毒的致病力有關(guān)。另外根據(jù)已有的大量報(bào)道，PA亞基被發(fā)現(xiàn)不但參與病毒復(fù)制過程，而且還參與病毒RNA轉(zhuǎn)錄、內(nèi)切核酸酶活性、蛋白酶活性以及參與病毒粒子組裝等多種病毒活動過程[6]。在此研究中，小鼠適應(yīng)株P(guān)1的NA蛋白，P9的HA蛋白,NA蛋白以及PA蛋白共發(fā)生4處突變，分別為：HA蛋白143位的Ala突變?yōu)門hr；NA蛋白10位的Thr突變?yōu)閘le，168位的Ser突變?yōu)镮le；PA蛋白4位的Phe突變?yōu)镃ys。三個(gè)與病毒致病性和毒力相關(guān)的位點(diǎn)均發(fā)生了突變，但經(jīng)傳代后的病毒毒力與致病力是否改變?nèi)孕韬罄m(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈蕊華，李子華. 禽流感病毒[J]; 海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志；2002(8)5：28-29.

[2] 楊飛飛，蔣琳，金嘉琳，等；上海市人感染H7N9禽流行性感冒死亡一例報(bào)道及相關(guān)文獻(xiàn)綜述[J]；中華傳染病雜志；2013(1)4：197-200.

[3] Tang JW, et al. Emerging, novel, and known influenza virus infections in humans [J]. Infect Dis Clin North Am. 24(3): 603-617.

[4] Matsuyama, T., Sweet, C., Collie, M. H. & Smith, H.. Aspects ofvirμLence in ferrets exhibited by influenza virus recombinants of known genetic constitution [J]. Journal of Infectious Diseases 1980，141, 351-361.

[5] 鮑琳琳，孫惠惠，秦川，等A/California/7/2009與A/California/4/2009病毒感染力比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2010(20)1，26-28.

[6] Xiaojing H, Jie Z, Bartlam M, et al. 流感病毒聚合酶 PA 亞基與 PB1 多肽復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)[J]. 中國基礎(chǔ)科學(xué), 2009, 11(2)，32-36.

[7] 忻悅, 于志君, 程凱慧, 等. H6 亞型流感病毒在小鼠肺內(nèi)的適應(yīng)性傳代研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2012, 7(009): 641-643.