彭雨婷，武 昕，孔祥平，李紹林,劉光澤

(1. 解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心轉(zhuǎn)基因工程室，廣州 510602；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, Fah)基因敲除小鼠，簡(jiǎn)稱Fah-/-小鼠，是由Grompe等[1]建立的酪氨酸血癥Ⅰ(tyrosinemia type I, HT1)小鼠模型。該模型由于Fah的缺失，導(dǎo)致酪氨酸代謝受阻，毒性代謝產(chǎn)物蓄積，引起肝、腎的嚴(yán)重?fù)p傷[2-3]。2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基)-環(huán)己烷-1,3-二酮(NTBC)藥物能夠抑制酪氨酸降解通路中4-對(duì)羥基苯丙酮酸雙氧化酶(4-HPPD)的活性，減少有毒代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，臨床上用于治療高酪氨酸血癥[4]。Fah-/-小鼠存在廣泛而持續(xù)的肝損傷，可用于細(xì)胞移植、肝臟持續(xù)損傷、肝再生及肝癌的研究中[5-9]。本研究觀察Fah-/-小鼠對(duì)NTBC的藥物依賴性，更詳盡的掌握該模型的生物學(xué)特征，使該模型得以更有效的利用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)balb/c品系Fah-/-小鼠，體重23～25 g，10周齡公鼠24只，10周齡孕鼠51只，受贈(zèng)于廈門大學(xué)，由解放軍第四五八醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)繁殖，飼養(yǎng)時(shí)飲用水中添加8 mg/L NTBC；SPF級(jí)balb/c品系野生型小鼠8只，體重23～25 g，10周齡，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0015】，由解放軍第四五八醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供及飼養(yǎng)【SYXK(軍)2012-0059】。正常進(jìn)食。

動(dòng)物飼養(yǎng)條件為：12h光照/12h黑暗節(jié)律，所有動(dòng)物都用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器

2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基)-環(huán)己烷-1,3-二酮 (NTBC)購(gòu)自上海瑞博化學(xué)有限公司(CAS：104206-65-7)；蘇木素、伊紅購(gòu)自福州邁新生物科技有限公司；中性樹(shù)脂封片劑購(gòu)自武漢博士德公司；石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；恒溫烤箱購(gòu)自北京醫(yī)療設(shè)備廠；正置顯微鏡購(gòu)自日本Olymphas公司；不銹鋼高壓鍋購(gòu)自福州邁新生物科技有限公司；顯微專業(yè)數(shù)碼圖像系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司；十萬(wàn)分之一天平購(gòu)自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 觀察NTBC對(duì)Fah-/-小鼠形態(tài)學(xué)和體重的影響

將24只10周齡Fah-/-小鼠分為三組：a.對(duì)照組(n=8)，服用NTBC；b.實(shí)驗(yàn)組1(n=8)，間歇停藥，具體是停藥3周后，持續(xù)給藥2周，繼續(xù)停藥；c.實(shí)驗(yàn)組2(n=8)，停藥不重復(fù)給藥。記錄小鼠生存狀態(tài)，形態(tài)學(xué)變化，每周稱重兩次，取各組體重均值，繪制體重曲線。

1.2.2 血清學(xué)檢測(cè)

Fah-/ -小鼠停藥組在第1,2,3,4,5,6周眼眶采血，離心分離獲得血清，檢測(cè)血清中ALB,AST,ALT,ALP水平[10]。

1.2.3 肝臟病理學(xué)檢測(cè)

1.2.3.1 制備組織切片

分別取Balb/c野生小鼠和NTBC停藥第0,1,2,3,4,5,6周的Fah-/-小鼠小鼠的肝臟相同部位(0.8 cm × 0.8 cm × 0.3 cm)，生理鹽水清洗，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2.3.2 蘇木素、伊紅(HE)染色

60℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色5～10 min，水中返藍(lán)5～10 min，1%鹽酸酒精溶液分化 3～10 s，水洗2 min，伊紅復(fù)染5～10 min，水洗2 min，切片常規(guī)脫水透明干燥，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 NTBC對(duì)Fah- / -小鼠繁殖情況影響

統(tǒng)計(jì)2013年4月至2014年4月一年內(nèi)Fah- / -小鼠每窩產(chǎn)仔數(shù)量，與野生型窩產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較[11]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

利用spss19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析和單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NTBC對(duì)Fah- / -小鼠形態(tài)學(xué)和體重的影響

對(duì)照組：Fah-/-小鼠飲用水中一直給予NTBC，體重穩(wěn)步增長(zhǎng)，健康存活。實(shí)驗(yàn)組1：Fah-/-小鼠第一次停藥，體重進(jìn)行性下降，3周后體重為初始體重的70%～80%，有顯著性差異(P< 0.05)，第3周飲用水中給與NTBC，第5周體重回升到初始體重后再次停藥，體重維持一周后再次呈進(jìn)行性下降，小鼠最終存活時(shí)間為7～10周。實(shí)驗(yàn)組2：從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，F(xiàn)ah-/-小鼠停止給予NTBC，體重呈進(jìn)行性下降，小鼠最終存活時(shí)間5～7周。體重曲線見(jiàn)圖1。

Fah-/-小鼠停藥后活力逐漸降低，3周后出現(xiàn)弓背，毛刺，連續(xù)停藥5周后肢體行動(dòng)不協(xié)調(diào)，易呈昏睡狀，且體重明顯減輕(P< 0.05)；如果再次給藥，其狀態(tài)、體重可逐漸恢復(fù)，生活狀態(tài)也有所改善；死亡時(shí)體重約為初始體重的60%～70%。

注：對(duì)照組：持續(xù)給藥NTBC；實(shí)驗(yàn)組1：間歇停藥NTBC。實(shí)驗(yàn)組2：持續(xù)停藥NTBC。

2.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

停藥后，F(xiàn)ah-/-小鼠從第2周后ALB持續(xù)降低，ALT、AST、ALP指標(biāo)逐漸升高，從第3周開(kāi)始有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)(見(jiàn)圖2)。

圖2 Fah-/-小鼠去除NTBC后血清學(xué)指標(biāo)隨時(shí)間的變化曲線

2.4 肝組織病理學(xué)觀察

對(duì)照組1：Balb/c野生型小鼠肝臟，肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉輪廓清晰，細(xì)胞排列緊密有序，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞漿充盈。對(duì)照組2：給藥NTBC，F(xiàn)ah-/-小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)與野生型相似，無(wú)炎性病癥。實(shí)驗(yàn)組：隨著停用NTBC的時(shí)間的增加，肝臟正常組織結(jié)構(gòu)消失，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞逐步浸潤(rùn)，肝細(xì)胞由點(diǎn)狀壞死向灶狀、片狀壞死發(fā)展，肝細(xì)胞索排列紊亂，細(xì)胞界限不清晰，體積增大，核收縮，胞漿疏松。4周后胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量的脂肪空泡和氣球樣變性，肝細(xì)胞大量壞死并伴有嚴(yán)重的炎性病癥和細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖3,彩插1)。

2.5 NTBC對(duì)Fah- / -小鼠繁殖情況影響

2013年4月到2014年4月，一年中繁殖Fah-/-小鼠51窩，平均窩產(chǎn)仔7.29只，Balb/c野生鼠平均窩產(chǎn)仔7.56只。P> 0.05，F(xiàn)ah-/-小鼠窩產(chǎn)仔情況與Balb/c野生型無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。終身服藥NTBC對(duì)Fah- / -小鼠繁殖能力無(wú)明顯影響。

3 討論

Fah-/-小鼠肝損傷原理同酪氨酸血癥Ⅰ型的發(fā)病機(jī)制。酪氨酸血癥Ⅰ型是一種少見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，又稱肝腎型酪氨酸血癥，患病率約為1/2000至1/10 000。其發(fā)病機(jī)制主要是由于肝、腎組織中延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)活性降低或缺失，導(dǎo)致酪氨酸代謝途徑的終端代謝發(fā)生障礙，不能正常代謝延胡索酸和乙酰乙酸。延胡索酰乙酰乙酸積累，其上游代謝物酪氨酸、4-羥基苯丙酮酸升高，使中間代謝產(chǎn)物馬來(lái)酰乙酰乙酸進(jìn)一步積累，刺激產(chǎn)生旁代謝途徑。馬來(lái)酰乙酰乙酸和延胡索酰乙酰乙酸經(jīng)旁代謝生成琥珀酰乙酰乙酸，后又再生成琥珀酰丙酮(SA)。這兩種旁代謝產(chǎn)物可以與蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合，二者含量增高造成嚴(yán)重的肝損傷及腎小管缺陷[13-14]，肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是這種疾病的主要特征。目前，臨床上通過(guò)琥珀酰丙酮診斷酪氨酸血癥Ⅰ型。

2-硝基-4-三氟甲苯-1,3環(huán)乙垸碘(NTBC)，又稱尼替西農(nóng)，能夠抑制酪氨酸降解通路第二步4-對(duì)羥基苯丙酮酸雙氧化酶(4-HPPD)的活性，從而減少下游旁代謝途徑中的有毒代謝產(chǎn)物，起到治療作用。同時(shí)，NTBC抑制了酪氨酸向4-羥基苯丙酮酸的代謝，血酪氨酸增高，需控制蛋白質(zhì)的攝取?？偟膩?lái)說(shuō)，NTBC是替代肝腎移植治療酪氨酸血癥Ⅰ型最直接有效的方法。1992年，NTBC應(yīng)用于臨床治療，生存率>90%。

Fah-/-小鼠通過(guò)敲除Fah基因，模擬酪氨酸血癥Ⅰ型癥狀，肝損傷原理來(lái)自酪氨酸血癥Ⅰ型的發(fā)病機(jī)制。Fah-/-小鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中飲用水中添加8 mg/L的NTBC，不出現(xiàn)酪氨酸血癥Ⅰ型病癥，健康存活，生物學(xué)特性同野生型，是能夠穩(wěn)定遺傳、易繁殖的小鼠模型。當(dāng)NTBC停供，小鼠體重進(jìn)行性降低，可低至初始體重的60%～70%，5～7周死亡，損傷持續(xù)穩(wěn)定并未見(jiàn)自然恢復(fù)。生命活力3周后明顯降低，并伴有弓背、毛刺的現(xiàn)象；5周后開(kāi)始，精神不濟(jì)，肢體不勤，弓背程度加重。肝損傷發(fā)生后重新喂藥，損傷停止加劇，體重逐漸恢復(fù)。說(shuō)明Fah-/-小鼠對(duì)NTBC有嚴(yán)重藥物依賴性，不給與NTBC，F(xiàn)ah-/-小鼠不能存活，F(xiàn)ah-/-小鼠出現(xiàn)酪氨酸血癥Ⅰ型癥狀。但有實(shí)驗(yàn)指出對(duì)Fah-/-小鼠進(jìn)行多次的停藥喂藥實(shí)驗(yàn),反復(fù)的肝臟損傷和再生還可以誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生[15-16]。

血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果反映出肝臟呈持續(xù)性損傷。ALT與AST存在于肝細(xì)胞膜，能夠反映出肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜通透性的變化。停藥過(guò)程中，肝細(xì)胞逐漸壞死、凋亡，細(xì)胞膜破裂的同時(shí)釋放ALT與AST到血液，使血清中二者水平升高。ALT、AST、ALP水平與肝損傷程度呈正相關(guān)，ALP水平變化不如ALT、AST顯著；ALB水平與肝損傷程度呈負(fù)相關(guān)[12]，ALB降低呈現(xiàn)肝損傷加重。

停藥后肝組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征變化具有階段性，規(guī)律性，反映出不同階段的細(xì)胞損傷情況，小鼠肝臟損傷的時(shí)間和程度可以通過(guò)NTBC藥物的系統(tǒng)調(diào)節(jié)來(lái)進(jìn)行控制。在連續(xù)給藥的情況下，F(xiàn)ah-/-小鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)、生物學(xué)特性和生殖情況與野生型小鼠基本一致。當(dāng)對(duì)小鼠進(jìn)行斷藥處理后，逐漸有炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，發(fā)生炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞開(kāi)始大規(guī)模壞死，胞質(zhì)內(nèi)形成大塊脂肪空泡和氣球樣變性，停藥后期肝細(xì)胞壞死伴隨大量細(xì)胞凋亡，肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡導(dǎo)致肝臟損傷。

Fah-/-小鼠對(duì)NTBC有依賴性，需終身服用，NTBC能通過(guò)抑制下游旁代謝途徑中的有毒代謝產(chǎn)物產(chǎn)生來(lái)阻止Fah-/-小鼠肝損傷；Fah-/-小鼠模型可以很好的模擬人類酪氨酸血癥Ⅰ型產(chǎn)生的各種癥狀，是研究該遺傳病的理想模型；同時(shí)，該模型形成的持續(xù)性不可逆的肝損傷，也適用于研究外源細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的定植狀況。因此，F(xiàn)ah-/-小鼠模型被廣泛應(yīng)用于相關(guān)的肝病基礎(chǔ)研究、肝病細(xì)胞治療、肝臟持續(xù)損傷、肝再生及肝癌的研究領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：

[1] Grompe M, Al-Dhalimy M, Finegold M,etal. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice[J]. Genes & development, 1993, 7(12a): 2298-2307.

[2] Orejuela D, Jorquera R, Bergeron A,etal. Hepatic stress in hereditary tyrosinemia type 1 (HT1) activates the AKT survival pathway in thefah-knockout mice model[J]. Journal of hepatology, 2008, 48(2): 308-317.

[3] Qi Z, Wang X, Wei H,etal. Infiltrating neutrophils aggravate metabolic liver failure in fah‐deficient mice[J]. Liver International, 2014,DOI: 10.1111/liv.12594.

[4] Masurel-Paulet A, Poggi-Bach J, Rolland M O,etal. NTBC treatment in tyrosinaemia type I: long-term outcome in French patients[J]. Journal of inherited metabolic disease, 2008, 31(1): 81-87.

[5] Su B L, Liu C C, Xiang D,etal. Xeno-repopulation of Fah-/-Nod/Scid mice livers by human hepatocytes[J]. Science China Life Sciences, 2011, 54(3): 227-234.

[6] Buitrago‐Molina L E, Marhenke S, Longerich T,etal. The degree of liver injury determines the role of p21 in liver regeneration and hepatocarcinogenesis in mice[J]. Hepatology, 2013, 58(3): 1143-1152.

[7] Alison M R, Lovell M J. Liver cancer: the role of stem cells[J]. Cell proliferation, 2005, 38(6): 407-421.

[8] Kubo S, Sun M, Miyahara M,etal. Hepatocyte injury in tyrosinemia type 1 is induced by fumarylacetoacetate and is inhibited by caspase inhibitors[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(16): 9552-9557.

[9] 蘇寶亮, 劉長(zhǎng)城, 李帥, 等. Fah 基因剔除小鼠在肝細(xì)胞移植中的應(yīng)用及其病理學(xué)變化[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009 9, 40(6): 553 - 558.

[10] Wilber A, Wangensteen K J, Chen Y,etal. Messenger RNA as a Source of Transposase for Sleeping Beauty Transposon-mediated Correction of Hereditary Tyrosinemia Type I[J]. Molecular Therapy, 2007, 15(7): 1280-1287.

[11] 張洪, 鮑波. 淺談國(guó)內(nèi)BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物學(xué)特性[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2010 (3): 252-254.

[12] 魏立,張麗娟, 張躍新. 肝病患者血清學(xué)指標(biāo)與肝纖維化程度的關(guān)系[J]. 標(biāo)記免疫分析與臨床, 2009, 16(4): 205-208.

[13] Fernandes J, Saudubray J M, Van Den Berghe G,etal. Inborn metabolic diseases: diagnosis and treatment[M]. Springer, 2006:233-243.

[14] 楊楠, 韓連書(shū), 葉軍, 等. 尼替西農(nóng)治療2例酪氨酸血癥Ⅰ型的效果分析并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J]. 臨床兒科雜志, 2012, 29(12): 1178-1181.

[15] Nieto N, Friedman SL, Cederbaum Al. Stimulation and proliferation of primary rat hepaticstellate cells by cytochrome P450 2E1-derived reactive oxygen species[J]. Hepatology,2002, 35 (1): 62-73.

[16] Nieto N. Ethanol and fish oil induce NFkappaB transactivation of the collagen alpha2(l)promoter through lipid peroxidation-driven activation of the PKC-PI3K-Akt pathway [J].Hepatology, 2007, 45 (6): 1433-1445.