鄧建新， 劉文娟， 林澤勛， 王永輝， 閻德文

(深圳大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科， 2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 深圳 518060; 3南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510515)

在心肌細(xì)胞的興奮收縮過程中，鈣離子起著至關(guān)重要的橋梁作用。心肌細(xì)胞興奮引起膜上的L-型鈣通道(L-type calcium channel，LCC)開放，鈣離子從胞外進(jìn)入胞內(nèi)。進(jìn)入的鈣離子又激活雷諾丁受體(ryanodine receptor，RyR)鈣釋放通道，肌漿網(wǎng)中的鈣庫瞬時打開，使得胞內(nèi)鈣濃度瞬間升高，最終引起細(xì)胞的收縮。鈣火花是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum， SR)上單個鈣釋放單元中雷諾丁受體隨機性的開放事件，其發(fā)現(xiàn)使得我們可以借助激光共聚焦顯微鏡實時觀察到鈣釋放單元(Ca2+release unit，CRU)激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)鈣離子外流的情況，它是反映陣列RyR 的門控及其所形成的微鈣區(qū)域信號?！扳}火花”(Ca2+spark)及其相關(guān)鈣信號事件是近百年來生理學(xué)研究領(lǐng)域的一個重大的發(fā)現(xiàn)，它們揭示了鈣信號局部控制的新機制，以及細(xì)胞內(nèi)精細(xì)的鈣信號結(jié)構(gòu)體系。

近年來，糖尿病的發(fā)病率在我國急劇上升，目前已有超過9 400萬的糖尿病患者，此外尚有約 1.5億中國人處于糖尿病前期，中國已成糖尿病患者大國[1]。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是機體在長期高糖狀態(tài)時蛋白質(zhì)和還原糖之間經(jīng)過非酶性糖基化反應(yīng)生成的物質(zhì)，它被認(rèn)為是糖尿病最主要的致病物質(zhì)之一。很多的疾病如糖尿病、炎癥、腎功能衰竭等都可以引起AGEs的聚集。已有的研究表明AGEs 主要通過與其受體RAGE作用從而促發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致 ROS 大量產(chǎn)生, 促進(jìn)一系列炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞的損傷。但是AGEs對心肌細(xì)胞鈣信號調(diào)控機制尚不完全清楚。

材 料 和 方 法

1 材料

1～3 d SD乳鼠20只，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。AGEs由南方醫(yī)科大學(xué)黃巧冰教授惠贈；膠原酶II購于Worthington；5-溴脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶購于Sigma；DMEM培養(yǎng)基和 新生牛血清為Gibco產(chǎn)品； Fluo-4 AM購于Invitrogen；其余無特別說明為國產(chǎn)分析純。主要的儀器為Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

2 方法

2.1乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 用胰蛋白酶消化方法[2]把1～3 d 齡 SD大鼠心室肌消化成單細(xì)胞懸液。經(jīng)差速法貼壁心肌細(xì)胞：37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60～90 min，分離純化心肌細(xì)胞。將純化的細(xì)胞按1×105細(xì)胞數(shù)接種于35 mm培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿事先加入了共聚焦專用玻片),培養(yǎng)24 h后饑餓2 h，然后加入不同濃度的AGEs進(jìn)行刺激，8 h后進(jìn)行鈣火花檢測實驗[3]。

2.2熒光染料的加載 把鈣熒光指示劑Fluo-4 AM(5 μmol/L)與細(xì)胞共同孵育10 min(室溫、避光)，之后清洗3次，以去除多余的熒光染料。將加載好熒光染料的細(xì)胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺上，以臺氏液灌流細(xì)胞等待實驗。

2.3鈣火花的采集 由于鈣火花的發(fā)放速度快、時程短，因此采用線掃描的方式進(jìn)行捕捉。 在400倍鏡下，固定激光強度為2%，隨機選取橫紋清晰、無自主跳動的細(xì)胞，采樣速率為每線3.07 ms，采集1 000條線，在采集過程中放大倍數(shù)和采樣速度應(yīng)盡量保持一致以便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。激發(fā)光波長為488 nm，收集波長為505 nm以上的發(fā)射光。鈣火花圖像采用IDL 6.3軟件進(jìn)行處理。參照以往的方法[4]，選取無鈣信號釋放區(qū)域進(jìn)行靜息鈣水平的分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件分析。統(tǒng)計方法為單因素方差分析，方差齊時采用LSD法，方差不齊時組間比較采用Welch檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AGE增加鈣火花的發(fā)放頻率

結(jié)果表明,AGEs可以顯著增加心肌細(xì)胞自發(fā)鈣火花的發(fā)放頻率。對照組的鈣火花發(fā)放頻率為1.56±0.13 (n=274), 10 mg/L AGEs 組為2.31±0.24 (n=258)，50 mg/L AGEs 組自發(fā)鈣火花的發(fā)放頻率為4.68±0.30 (n=180)，150 mg/L AGEs 組鈣火花的發(fā)放頻率為3.59±0.25 (n=158),見圖1。

Figure 1. AGEs increased spontaneous calcium sparks frequency.Mean±SEM.**P<0.01 vs control.

2 AGEs 改變自發(fā)鈣火花的形態(tài)

在觀察AGEs 調(diào)控鈣火花發(fā)放頻率的同時，發(fā)現(xiàn)AGEs可以影響鈣火花的形態(tài)學(xué)特性。選取各組的鈣火花通過三維重組技術(shù)后可以看出，AGEs使得鈣火花的大小減小,見圖2。在分析的鈣火花動力學(xué)時，我們著重分析鈣火花的4個特征：鈣火花峰值幅度(amplitude, F/F0)、空間半高寬(full width at half maximum, FWHM；空間變化曲線中高于峰值1/2的曲線部分所對應(yīng)的距離計算)、持續(xù)時程(full du-ration at half maximum, FDHM；時間變化曲線中高于峰值1/2的曲線部分所持續(xù)的時間)和上升時間(rise time，RT；指鈣火花起始處到峰值處所經(jīng)歷的時間)均有不同程度的變化,見表1。

Figure 2. AGEs changed spontaneous calcium sparks morphology. A: typical calcium spark line scan image; B: single three-dimensional diagram of recombinant calcium sparks

3 AGEs增加心肌細(xì)胞靜息期肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣水平

結(jié)果顯示，AGEs組略微增加靜息期內(nèi)鈣離子水平，鈣離子水平對照組為48.25±1.57，10 mg/L AGEs組(51.04± 2.01)與對照組相比差異不明顯，50 mg/L AGEs組(53.45±2.28)和150 mg/L AGEs 組(60.27±4.28)均較對照組明顯升高(P<0.05或P<0.01),見圖3。

表1 AGEs改變鈣火花形態(tài)學(xué)指標(biāo)

Figure 3. Effects of AGEs on cardiomyocyte resting Ca2+.Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

討 論

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)AGEs可以增強肌漿網(wǎng)中RyR的活性，使得心肌細(xì)胞自發(fā)鈣火花發(fā)放頻率增加,并使鈣火花的形態(tài)發(fā)生改變。鈣火花形態(tài)反映了豐富的信息，包括CRU 的門控、釋放的離子流、微觀尺度的鈣擴(kuò)散及這些過程的生理調(diào)控。鈣火花反映的是單個或少數(shù)幾個RyR的同步開放。鈣火花的發(fā)放頻率及功能特性反映舒張期RyR的功能活動，同時還反映SR鈣庫和胞漿鈣的平衡狀態(tài)[5]。鈣火花的發(fā)現(xiàn)，使人們得以在完整細(xì)胞更接近生理條件下研究RyR的功能。

正常靜息心肌細(xì)胞，RyR通道主要處于關(guān)閉狀態(tài)，只有零星的鈣火花發(fā)放，有利于維持正常的SR鈣庫容量。但若病理刺激引起舒張期RyR通道開放異常增加，勢必導(dǎo)致SR鈣漏流增強，SR鈣庫容量減少，使心肌收縮力減弱。SR鈣漏流還引起心肌細(xì)胞鈣超載，從而造成心肌細(xì)胞的損傷。近些年來，一系列研究工作發(fā)現(xiàn)心力衰竭的心肌細(xì)胞SR鈣漏流增加，是引起心衰的一個重要機制[4，6-9]。

借助鈣火花成像技術(shù)，Yaras等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠5周時離體心肌細(xì)胞鈣火花頻率顯著增加。與此同時，還發(fā)現(xiàn)靜息期胞漿鈣濃度升高(鈣超載)，收縮期鈣瞬變幅度降低，心肌收縮力減弱。AGEs對離體心肌細(xì)胞的作用與之相似，因此，我們有理由相信，AGEs引起的鈣火花增加介導(dǎo)的鈣漏流的產(chǎn)生，進(jìn)而引起肌漿網(wǎng)鈣庫的下降，另外AGEs引起的鈣超載也對心肌細(xì)胞造成損傷，最終引起收縮期心肌收縮力的下降。這可能是糖尿病性心肌病心功能不全的重要機制。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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